単一細胞DNAテンプレート鎖配列決定

単一細胞DNAテンプレート鎖シーケンシング（Strand-seq ）は、娘細胞の親テンプレート鎖を選択的にシーケンシングする技術である。 ^[1] この技術は、分離前の親細胞における姉妹染色分体交換の特定、姉妹染色分体の非ランダムな分離の評価、ゲノムアセンブリにおける誤った方向のコンティグの特定、ヒトを含む二倍体生物における両ハプロタイプのde novoゲノムアセンブリ、全染色体ハプロタイピング、生殖細胞系列および体細胞のゲノム構造変異の特定（後者は単一細胞でも確実に検出可能）など、多岐にわたる用途がある。

ストランドシークエンシング（単一細胞および単一鎖シークエンシング）は、2012年に説明された最初の単一細胞シークエンシングプロトコルの1つでした。 ^{[1]このゲノム技術は、単一の娘細胞の}DNAライブラリ内の親テンプレート鎖を選択的にシークエンシングします。^[1]概念実証研究として、著者らは、染色分体分離モードに応じて、個々のDNAライブラリ内のワトソン染色体鎖および/またはクリック染色体鎖から配列情報を取得する機能を実証しました。一般的なDNAライブラリには、常に両方の鎖のDNAが含まれます。著者らは特に、高解像度で姉妹染色分体交換（SCE）を検出する際のストランドシークエンシングの有用性を示すことに興味を持っていました。著者らは、マウス胚性幹（meS）細胞株で最大23 bpの解像度で8つの推定SCEを特定することに成功しました。この方法は、特に幹細胞系統において、非ランダムな染色分体分離のパターンを識別するのに非常に有用であることが示されています。さらに、SCE はゲノムストレスの診断指標として関係付けられており、これは癌生物学で有用な情報です。このトピックに関するほとんどの研究は、多くの細胞発達サイクルを通じて染色体テンプレート鎖の配列を観察し、非ランダムな配列を特定の細胞運命と相関させることに関係しています。単一細胞シーケンス プロトコルはこの技術の開発の基礎となりましたが、いくつかの点で異なります。

これまでの方法は、染色分体の遺伝パターンを鎖ごとに追跡し、非ランダムな分離のプロセスを解明するために使用されてきました。

パルスチェイス実験は、他の時間依存的な細胞プロセスの研究に加えて、染色体の分離パターンを決定するために使用されてきました。^[2]簡単に言えば、パルスチェイスアッセイにより、研究者は細胞内の放射性標識分子を追跡できます。非ランダムな染色体配列を研究するために使用される実験では、複製されたDNA鎖に組み込まれたヌクレオチド類似体で幹細胞を標識または「パルス」します。^{[3]これにより、新生のスタンドを多くの}複製ラウンドを通じて追跡できます。残念ながら、この方法は染色分体レベルでしか観察できないため、解像度が低いことがわかりました。

CO-FISH、すなわち鎖特異的蛍光in situハイブリダイゼーションは、蛍光タグ付きプローブによるDNAの鎖特異的標的化を容易にする。^{[4]これは、}テロメアの方向に対する主要なサテライトの均一な配向を利用し、これにより鎖を「ワトソン」鎖または「クリック」鎖として明確に指定することができる。主要なサテライト領域を認識する一方向性プローブを蛍光標識染料と組み合わせることで、個々の鎖を結合することができる。^[4]テンプレート鎖のみが標識されるようにするには、新しく形成された鎖をBrdUの取り込みと光分解によって分解する必要がある。このプロトコルは細胞遺伝学的解像度を向上させ、研究者がパルスチェイス実験で染色分体全体ではなく単一の鎖を観察することを可能にする。さらに、主要なサテライトマーカーを標的とすることで、染色分体の非ランダムな分離を直接アッセイすることができる。

対象となる細胞は、生体内または試験管内で培養されます。S期に細胞はブロモデオキシウリジン(BrdU)で処理され、これが新生 DNA に組み込まれてチミジンの代わりとして機能します。少なくとも 1 つの複製イベントが発生した後、娘細胞は G2 期で同期され、蛍光活性化セルソーティング (FACS)によって個別に分離されます。細胞は溶解バッファーに直接分類され、DNA が抽出されます。指定された世代数 (通常は 1) で停止すると、姉妹染色分体の遺伝パターンを評価できます。以下の方法では、単一の娘細胞の DNA の DNA 配列決定に重点が置かれます。この時点で、染色体はチミジンの代わりに BrdU を含む新生鎖で構成され、元のテンプレート鎖は DNA 配列決定ライブラリの準備のために準備されます。このプロトコルは2012年に公開されているため、^[1]標準的な方法論はイルミナのシーケンシングプラットフォームについてのみ詳しく説明されています。このプロトコルは、アプリケーションに応じて他のシーケンシングプラットフォームに簡単に適応できます。次に、DNAを特殊な色素とともにインキュベートし、BrdU-色素複合体が紫外線で励起されると、新生鎖が光分解によって切断されます。このプロセスにより、新生鎖のポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 増幅が阻害され、親テンプレート鎖のみが増幅されます。ライブラリの構築は、イルミナのペアエンドシーケンシングの場合と同様に進行します。次に、マルチプレックスPCRプライマーをPCRアンプリコンにライゲーションし、各フラグメントがどの細胞に由来するかを識別するヘキサマーバーコードを作成します。単一細胞シーケンシングプロトコルとは異なり、Strand-seqはDNA増幅に多重置換増幅やMALBACを使用しません。むしろ、PCRに完全に依存しています。

Strand-seq の現在のアプリケーションの大部分は、シーケンスされたリードを参照ゲノムにアラインメントすることから始まります。アラインメントは、BWA や Bowtie などのさまざまなショートリードアライナーを使用して実行できます。 ^{[5] [6]}単一細胞からの Strand-seq リードを参照ゲノムにアラインメントすることで、継承されたテンプレート鎖を決定できます。細胞が複数世代後にシーケンスされた場合、特定の細胞系統の染色分体の組み合わせのパターンを確認できます。Bioinformatic Analysis of Inherited Templates (BAIT) は、Strand-seq 方法論から生成されたリードのみを分析する最初のバイオインフォマティクスソフトウェアでした。^[7]これは、リードを参照シーケンスにアラインメントすることから始まり、ゲノムをセクションにビニングし、最後に各ビンに含まれる Watson および Crick リードの数をカウントします。ここから、BAIT は SCE イベント、参照ゲノム内の誤った方向のコンティグ、異数性染色体、および姉妹染色分体の分離モードの識別を可能にします。また、初期構築ゲノムのアセンブリと、後期構築ゲノム内の場所へのオーファン スキャフォールドの割り当てにも役立ちます。BAIT に続いて、Strand-seq データをさまざまな用途に使用するバイオインフォマティクス ツールが最近多数導入されました (たとえば、ハプロタイピング、de novo ゲノム アセンブリ、および単一細胞内の構造的変異の発見に関する次のセクションを、それぞれのリンクされた記事とともに参照してください)。

Strand-seq では、BrdU 標識のために細胞分裂中の細胞が必要なため、ホルマリン固定標本や非分裂細胞には適用できません。しかし、新鮮または凍結した一次標本を使用することで、正常な有糸分裂細胞や組織、オルガノイド、白血病や腫瘍のサンプルに適用できます。Strand-seq は Illumina シーケンシングを使用しており、異なるシーケンシング技術からの配列情報を必要とするアプリケーションでは、新しいプロトコル、または最近紹介したように異なるシーケンシング プラットフォームを使用して生成されたデータの統合が必要です。^{[8] [9]}

Strand-seq について記述した最初の論文の著者らは、SCE のマッピングで 23bp の解像度を達成できたことを示しており、他の大きな染色体異常もこのマッピング解像度を共有できる可能性があります (ブレークポイントのファイン マッピングが実行された場合)。ただし、解像度は、使用するシーケンシング プラットフォーム、ライブラリ準備プロトコル、分析する細胞数、および細胞あたりのシーケンシングの深さの組み合わせに依存します。ただし、ホモポリマー反復でエラーが発生しないシーケンシング技術を使用して精度をさらに向上させることは理にかなっています。

Strand-seq は当初、姉妹染色分体交換を識別するためのツールとして提案されました。^[1]個々の細胞に局在するプロセスであるため、複数の細胞の DNA シーケンスでは当然これらの効果が分散し、SCE イベントが存在しないことが示唆されます。さらに、従来の単一細胞シーケンス技術では、異種増幅バイアスと二重鎖シーケンス情報のためにこれらのイベントを表示できないため、Strand-seq が必要になります。参照アライメント情報を使用すると、継承されたテンプレート鎖の方向性が変化した場合に研究者は SCE を識別できます。

誤った向きのコンティグは、参照ゲノム中にかなりの割合で存在します（例：マウス参照ゲノムでは1％）。^{[1] [10]}従来のシーケンシング方法とは対照的に、Strand-seqはこれらの誤った向きを検出できます。^[1]誤った向きのコンティグは、鎖の継承が1つのホモ接合状態から他のホモ接合状態に変化する場所に存在します（例：WWからCC、またはCCからWW）。さらに、この状態の変化はすべてのStrand-seqライブラリで確認でき、誤った向きのコンティグの存在を裏付けています。^[7]

1960 年代以前は、姉妹染色分体は娘細胞にランダムに分離すると考えられていました。しかし、それ以来、姉妹染色分体の非ランダムな分離が哺乳類細胞で観察されています。^{[11] [12]}非ランダムな分離を説明するために、不滅鎖仮説やサイレント姉妹仮説などいくつかの仮説が提案されており、そのうちの 1 つは、Strand-seq を含む方法によって検証される可能性があります。

「不滅の鎖仮説」

細胞分裂のたびに突然変異が発生します。特定の長寿命細胞（例：幹細胞）は、これらの突然変異の影響を特に受けます。不死鎖仮説では、これらの細胞は親のテンプレート鎖を一貫して保持することで突然変異の蓄積を回避していると提唱されています[9]。この仮説が正しいためには、各染色体からの姉妹染色分体がランダムでない方法で分離する必要があります。さらに、1つの細胞は各分裂後にまったく同じテンプレート鎖のセットを保持し、残りを分裂の他の細胞産物に渡します。^[13]

「サイレントシスター仮説」

この仮説は、姉妹染色分体は異なるエピジェネティックシグネチャを持ち、それによって発現制御も異なるというものです。複製が起こると、姉妹染色分体の非ランダムな分離によって娘細胞の運命が決定されます。^[14]この仮説の妥当性を評価するには、両方の娘細胞のStrand-seqと遺伝子発現プロファイルの共同分析が必要になります。^[13]

BAITの出力は、ゲノムに沿った親のテンプレート鎖の継承を示します。^[7]通常、各常染色体には2つのテンプレート鎖が継承され、この数からの逸脱は異数性の例を示し、単一細胞で視覚化できます。

逆位はコピー数バランスの構造変異の一種で、Strand-seqで容易に可視化できる鎖の方向性の変化をもたらします。そのためStrand-seqは、イルミナのシーケンシングではアクセスできないことが知られている大きなセグメント重複に埋め込まれたメガベースサイズのイベントを含む、ヒトや霊長類の多型逆位を容易に検出するために使用できます。^{[15] [16]}

2019年にオンラインで発表された研究では、さらに、Strand-seqを使用することで、単一細胞またはサブクローンにおいて、欠失、重複、逆位、逆位重複、均衡転座、不均衡転座、切断-融合-橋かけサイクルを介した複雑なDNA再編成、およびクロモトリプシスイベントを含む200kb以上のすべてのクラスの構造変異が、単一細胞3チャネル処理（scTRIP）を使用して高感度に検出されることが実証されました。scTRIPは、読み取り方向、読み取り深度、およびハプロタイプ位相の共同モデリングを介して機能し、単一細胞内のSVを検出します。^[17] scTRIPを使用すると、構造変異は染色体長ハプロタイプによって解決され、他の現在のテクノロジーよりも高い感度と特異性を単一細胞構造変異呼び出しに与えます。^[17] scTRIPは変異呼び出しのために単一細胞内の構造変異の境界（またはブレークポイント）を横断するリード（またはリードペア）を必要としないため、単一細胞での構造変異解析を混乱させる傾向がある全ゲノム増幅に基づく単一細胞法の既知のアーティファクト（いわゆるリードキメラ）の影響を受けません。^[17]

初期構築ゲノムは、順序も方向もないコンティグでかなり断片化されています。Strand-seq を使用すると、配列に付随する方向性情報が提供され、最終的にコンティグの配置を解決するのに役立ちます。同じ染色体に存在するコンティグは、SCE イベントが発生していない限り、同じ方向性を示します。逆に、異なる染色体に存在するコンティグは、Strand-seq ライブラリの 50% でのみ同じ方向性を示します。^[7] ギャップによって交差する連続したコンティグであるスキャフォールドも同様の方法で特定できます。^[7]

大きなDNA分子を区別するために鎖の方向を使用するという同じ原理により、Strand-seqをテロメアからテロメアまでの遺伝的変異の全染色体ハプロタイプを構築するツールとして使用することが可能になります。^[18]

最近の報告によると、Strand-seqはロングリードシーケンシング技術と計算的に統合でき、両方の技術の独自の利点により、非常に連続したハプロタイプを解明したde novoヒトゲノムアセンブリを生成できることが示されています。^[8]これらのゲノムアセンブリは、複雑なゲノム遺伝子座にまたがる単一ヌクレオチド変異、インデル、構造変異など、あらゆる形態の遺伝的変異を統合し、最近では、異なる祖先を持つ人間の多様性パネルにおける構造変異の包括的なハプロタイプ認識マップを生成するために適用されています。^[9]

ゲノムDNA中のチミンがBrdUに置換されると二本鎖染色体切断が誘発され、特にSCEが生じる可能性は、文献で以前に議論されている。^{[19] [20]}さらに、BrdUの取り込みは鎖分離パターンに干渉することが示唆されている。^[13]これが事実であれば、偽陽性SCEが増大し、注釈が付けられる可能性がある。したがって、Strand-seqプロトコルを使用して多くの細胞を解析し、S​​CEが実際に集団内に存在することを確認する必要がある。単一細胞で検出された構造変異については、複数の細胞で同じ変異（同じハプロタイプ上）が検出されると、BrdUの取り込みが原因の可能性を除外できる。^[17]

アノテーションが受け入れられるためにシーケンスする必要がある単一細胞ストランドの数はまだ提案されておらず、尋ねられている質問に大きく依存します。Strand-seq は単一細胞シーケンス技術に基づいているため、単一細胞シーケンスが直面する問題も考慮する必要があります。これには、細胞の分離と増幅の標準が欠如していることが含まれます。以前の Strand-seq 研究では FACS を使用して細胞を分離しましたが、マイクロ流体も魅力的な代替手段となります。PCR は、MDA や MALBAC などのストランド置換ベースの方法と比較して、誤った増幅産物を生成することが示されていますが、後者の 2 つの技術は、副産物としてキメラリードを生成し、誤った構造変異呼び出しにつながる可能性があります。^{[21] [17]} MDA と MALBAC は、SV の検出中に Strand-seq よりも多くのドロップアウトを生成します。これは、SV の検出を可能にするために SV のブレークポイントを横切るリードが必要であるためです (これは、Strand-seq が検出できるさまざまな SV クラスのいずれにも必要ありません)。^[17]鎖置換増幅法では、より多くの配列とより長い産物が生成される傾向があり、ロングリードシーケンシング技術に有益となる可能性がある。

Wikibooks には、次世代シーケンシング (NGS)に関する本があります。

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