RNAサイレンシング

RNAサイレンシングまたはRNA干渉は、遺伝子発現がマイクロRNAなどの非コードRNAによって負に制御される遺伝子サイレンシング効果のファミリーを指します。RNAサイレンシングは、二本鎖RNA（dsRNA）によって引き起こされる遺伝子発現の配列特異的制御として定義されることもあります。 ^{[1] RNAサイレンシングのメカニズムは、ほとんどの真}核生物で保存されています。^[2] 最も一般的でよく研究されている例はRNA干渉（RNAi）であり、内因的に発現されたマイクロRNA（miRNA）または外因性に由来する低分子干渉RNA（siRNA ）が相補的なメッセンジャーRNAの分解を誘導します。piwi相互作用RNA（piRNA）^[3]とその亜種である反復関連低分子干渉RNA（rasiRNA ）など、他のクラスの低分子RNAも特定されています。^[4]

RNAサイレンシングは、遺伝子発現の制御と調節に関与する、メカニズム的に関連するいくつかの経路を指します。^{[5] [6] [7]} RNAサイレンシング経路は、相同配列の不活性化、エンドヌクレアーゼ活性の促進、翻訳停止、および/または染色体またはDNAの修飾に関与する因子として機能する小さな非コードRNA（長さ約20〜30ヌクレオチド）の調節活性に関連しています。^{[8] [9] [10]}この現象が最初に研究された文脈では、小さなRNAが植物をウイルスから守る上で重要な役割を果たすことがわかりました。たとえば、これらの研究では、酵素が通常細胞内に存在しない二本鎖RNA（dsRNA）を検出し、病気を引き起こすことができない小さな断片に分解することが実証されました。^{[11] [12] [13] [14] [2]}

RNAサイレンシングとその仕組みの一部の機能は理解されているが、多くは理解されていない。例えば、RNAサイレンシングは発達の調節や転座イベントの制御に重要であることがわかっている。^[15] RNAサイレンシングは、植物だけでなく昆虫でも抗ウイルス保護の役割を果たすことがわかっている。^[16]また、酵母では、RNAサイレンシングがヘテロクロマチン構造を維持することがわかっている。^[17]しかし、遺伝子発現の調節におけるRNAサイレンシングの多様で微妙な役割は、現在も進行中の科学的調査である。特徴付けられた小さなRNA配列の数が増えており、その範囲は多種多様な機能、例えば発達、神経細胞の運命、細胞死、増殖、脂肪の蓄積、造血細胞の運命、インスリン分泌の調節などが提案されている。^[18]

RNAサイレンシングは、塩基対の相補性の程度に応じて、翻訳を抑制するか、メッセンジャーRNA（mRNA ）を切断することによって機能します。RNAは、遺伝子をタンパク質に翻訳する際の媒介としての役割において主に研究されてきました。 ^[19]しかし、より積極的な調節機能は、1990年代後半から研究者によって取り上げられ始めました。^[20]最初に特定されたメカニズムを理解するための画期的な研究は、1998年にFireらによって発表され、^[1]二本鎖RNAが遺伝子サイレンシングのトリガーとして機能する可能性があることを実証しました。^[20]それ以来、さまざまな他のクラスのRNAサイレンシングが特定され、特徴付けられてきました。^[5]現在、これらの発見の治療可能性は、標的遺伝子治療の文脈で探究されています。^{[21] [22]}

RNAサイレンシングは進化を続けるメカニズムの一種ですが、共通するテーマは小さなRNAと遺伝子発現の基本的な関係です。^[9]また、現在特定されている主要なRNAサイレンシング経路には、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）^[23]とクロマチン依存性遺伝子サイレンシング（CDGS）経路の両方を含む可能性のある作用メカニズムがあることも観察されています。^[5] CDGSは、新生転写産物上の小さなRNA複合体の組み立てに関与しており、転写遺伝子サイレンシング（TGS）と共転写遺伝子サイレンシング（CTGS）イベントに関係する包括的な作用メカニズムと見なされています。^[24]これは、証拠が小さなRNAがクロマチン構造とTGSの調節に役割を果たしていることを示唆しているため、少なくとも重要です。^{[25] [26]}

文献では当初、メッセンジャーRNAの翻訳レベルで起こる中核的なメカニズムとしてRNA干渉（RNAi ）に焦点が当てられていたが、その後、DNAやクロマチンレベルで作用する保存されたRNAサイレンシング経路のより広範なファミリーの中で他のメカニズムも特定されている。 ^[27] RNAサイレンシングは、さまざまな小さなRNAのサイレンシング活動を指し、一般的にRNAiよりも広いカテゴリーと見なされている。これらの用語は文献では互換的に使用されることもあるが、一般的にRNAiはRNAサイレンシングの1分野と見なされている。これらの関連する概念を区別することが有用である限りにおいて、RNAサイレンシングは、遺伝子発現に関与する小さなRNA関連の制御のより広範なスキーム、および、変異を誘発する可能性のある可動性の反復DNA配列、レトロエレメント、およびトランスポゾンに対するゲノムの保護を指すものと考えられる。^[28] RNAサイレンシングの分子メカニズムは当初植物で研究されましたが^[13]、その後、真菌から哺乳類までさまざまな対象に広がり、これらの経路が高度に保存されているという強力な証拠が提供されています。^[29]

現在、少なくとも 3 つの主要なクラスの低分子 RNA、すなわち、低分子干渉 RNA ( siRNA )、マイクロ RNA ( miRNA )、およびpiwi 相互作用 RNA ( piRNA ) が特定されています。

siRNAは核と細胞質で作用し、RNAiとCDGSに関与している。^[5] siRNAは、センスRNAやアンチセンスRNAなどのさまざまな一本鎖RNA（ssRNA）前駆物質に由来する長いdsRNA前駆物質に由来する。siRNAは、逆方向反復領域の転写に由来するヘアピンRNAにも由来する。siRNAは、非コードRNA前駆物質から酵素的に発生することもある。^{[30] RNAiの枠組みの中での}siRNAに関する文献は膨大である。siRNAの強力な用途の1つは、1ヌクレオチドの違いで標的配列と非標的配列を区別できることである。このアプローチは、疾患を引き起こす変異アレルがwtアレルと1ヌクレオチド（nt）だけ異なる、サイレンシング優性機能獲得（GOF）疾患の治療に非常に重要であると考えられてきた。単一塩基の違いを区別する能力を持つこのタイプのsiRNAは、対立遺伝子特異的siRNAと呼ばれます。^[31]

miRNAの大部分は細胞質で作用し、mRNAの分解や翻訳停止を媒介します。^[32]しかし、一部の植物miRNAはDNAメチル化を促進するために直接作用することが示されています。^[33] miRNAは、RNaseIII酵素DroshaとDicerによって生成されるヘアピン前駆体に由来します。^[34] miRNAとsiRNAはどちらも、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC ）またはRNA誘導転写サイレンシング複合体（RITS）として知られるRISCの核型を形成します。 ^[35] RNAiの枠組みの中でのmiRNAに関する文献は膨大です。

メッセンジャー RNA (mRNA) の3 つの主要な非翻訳領域(3'UTR)には、転写後に RNA 干渉を引き起こす調節配列が含まれていることがよくあります。このような 3'-UTRには、マイクロ RNA (miRNA) の結合部位と調節タンパク質の結合部位の両方が含まれていることがよくあります。miRNA は、3'-UTR 内の特定の部位に結合することで、翻訳を阻害するか、転写産物を直接分解させることで、さまざまな mRNA の遺伝子発現を低下させることができます。3'-UTR には、mRNA の発現を阻害するリプレッサー タンパク質に結合するサイレンサー領域が含まれている場合もあります。

3'-UTR には、多くの場合、マイクロ RNA 応答エレメント (MRE)が含まれます。MRE は、miRNA が結合する配列です。これらは、3'-UTR 内でよく見られるモチーフです。3'-UTR 内のすべての調節モチーフ (サイレンサー領域など) のうち、MRE がモチーフの約半分を占めています。

2014年現在、miRNA配列と注釈のアーカイブであるmiRBaseウェブサイト^[36]には、233生物種の28,645のエントリが掲載されています。これらのうち、1,881のmiRNAは注釈付きのヒトmiRNA遺伝子座にありました。miRNAは平均で約400の標的mRNA（数百の遺伝子の発現に影響を与える）を持つと予測されています。^[37] Freidmanら^[37]は、ヒトmRNA 3'UTR内の45,000を超えるmiRNA標的部位がバックグラウンドレベルを超えて保存されており、ヒトタンパク質コード遺伝子の60％以上がmiRNAとの対合を維持するために選択圧を受けていると推定しています。

直接的な実験では、単一のmiRNAが数百のユニークなmRNAの安定性を低下させる可能性があることが示されています。^[38]他の実験では、単一のmiRNAが数百のタンパク質の生成を抑制する可能性があるが、この抑制は比較的軽度（2倍未満）であることが示されています。^{[39] [40]}

miRNAによる遺伝子発現の調節異常の影響は癌において重要であると思われる。^[41]例えば、消化器癌では、9つのmiRNAがエピジェネティックに変化し、DNA修復酵素のダウンレギュレーションに効果的であることが確認されている。^[42]

miRNAによる遺伝子発現の調節異常の影響は、統合失調症、双極性障害、うつ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害などの神経精神疾患においても重要であると考えられる。^{[43] [44] [45]}

piRNAは、動物細胞で発現する小さな非コードRNA分子の最大のクラスであり、反復DNAやトランスポゾンなど、さまざまなソースに由来します。^[46]しかし、piRNAの生合成は最もよく理解されていません。^[47] piRNAは、転写後レベルとクロマチンレベルの両方で作用するようです。少なくともサイズと複雑さの点でmiRNAとは異なります。反復関連低分子干渉RNA（rasiRNA）は、piRNAの亜種であると考えられています。^[4]

RNA サイレンシングの最も基本的なメカニズムの流れは次のとおりです。(メカニズムの詳細な説明については、RNAi: 細胞メカニズムの記事を参照してください。)

1:逆位反復ヘアピン/パンハンドル構造を持つRNA --> 2: dsRNA --> 3: miRNA / siRNA --> 4: RISC --> 5:標的mRNAの破壊

1. RNAサイレンシングを効果的に行うには、逆位反復配列を持つ一本鎖アンチセンスRNAが最適であることが分かっており、これが小さなヘアピンRNAとパンハンドル構造を形成します。^[7]ヘアピンまたはパンハンドル構造は、RNAが独立したまま他のRNA鎖とアニールしないようにするために存在します。
2. これらの小さなヘアピン RNAおよび/またはパンハンドルは、核外輸送受容体であるエクスポーチン 5 を介して核から細胞質に輸送され、DNA と同様にヌクレオチドの二重鎖である二重鎖 RNA である dsRNA に変換されます。このメカニズムが dsRNA を使用せず、一本鎖のみを使用する場合、他の「良好な」mRNA とハイブリダイズする可能性が高くなります。二重鎖であるため、必要なときにいつでも呼び出すことができます。
3. その後、dsRNA はDicerによって、 21～28 nt =ヌクレオチド長の miRNA (マイクロRNA ) またはsiRNA (短鎖干渉RNA) の小さな鎖に切断されます。Dicerはエンドリボヌクレアーゼ RNaseであり、RNA 鎖と混合されたタンパク質の複合体です。
4. 最後に、二本鎖のmiRNA / siRNA は一本鎖に分離します。2つのアンチセンス RNA鎖は、触媒成分Argonauteを含む RISC ( RNA 誘導サイレンシング複合体) と呼ばれる別のエンドリボヌクレアーゼ酵素複合体と結合し、RISC を誘導して「完全に相補的な」標的 mRNA またはウイルスゲノム RNA を分解し、破壊できるようにします。^{[2] [7]}
5. これは、短い配列の特定の領域に基づいて、対応する mRNA が切断されることを意味します。念のため、他の多くの場所でも切断されます。(このメカニズムが長い領域でのみ機能する場合、相補的な長い mRNA と一致する時間がない可能性が高くなります。) また、反復関連短鎖干渉 RNA ( rasiRNA ) がクロマチン修飾を誘導する役割を果たすことも示されています。^[2]

RNA サイレンシングは、私たちの細胞 (およびすべての界からの細胞) がRNA ウイルスやトランスポゾン(私たち自身の細胞や他の媒体に由来) と戦うために使用するメカニズムです。^[2] RNA ウイルスの場合、これらは上記のメカニズムによってすぐに破壊されます。トランスポゾンの場合は、もう少し間接的です。トランスポゾンはゲノムのさまざまな部分にあるため、さまざまなプロモーターからのさまざまな転写によって、互いにハイブリダイズできる相補的な mRNA が生成されます。これが起こると、RNAi 機構が作動し、トランスポゾン自体を移動させるために必要なタンパク質の mRNA を弱体化させます。^[48]

遺伝子のダウンレギュレーションの詳細な説明については、RNAi:遺伝子のダウンレギュレーションを参照してください。

遺伝子の上方制御の詳細な説明については、RNAi:遺伝子の上方制御を参照してください。

RNAサイレンシングが下流の標的mRNAを制御するのと同じように、RNAサイレンシング自体も制御されます。例えば、サイレンシングシグナルは、RdRP（ RNA依存性RNAポリメラーゼ）またはRDRと呼ばれる酵素群によって細胞間に広がります。^[2]

dsRNA を介した配列特異的 mRNA 分解を伴う小さな RNA 遺伝子サイレンシング メカニズムの理解が深まり、機能ゲノミクス、生物医学、実験生物学の分野に直接影響を与えています。次のセクションでは、RNA サイレンシングの影響を伴うさまざまなアプリケーションについて説明します。これには、バイオテクノロジー、治療、実験室研究での使用が含まれます。バイオインフォマティクス技術も、多数の小さな RNA とそのターゲットを識別して特徴付けるために適用されています。

長いdsRNAまたはsiRNAの人工的な導入は、培養細胞と生体の両方で遺伝子発現を不活性化するツールとして採用されてきました。^[2] RNAサイレンシングのエフェクターとしての小さなRNAの構造的および機能的解明は、実験生物学に直接的な影響を及ぼしてきました。たとえば、dsRNAは、目的の遺伝子に相補的な特定の配列を持つように合成される場合があります。細胞または生物系に導入されると、外因性の遺伝物質として認識され、対応するRNAサイレンシング経路を活性化します。このメカニズムは、ターゲットに関して遺伝子発現の減少をもたらすために使用でき、表現型に対する遺伝子の機能喪失を調査するのに役立ちます。つまり、発現減少の表現型および/または生理学的影響を研究することで、遺伝子産物の役割を明らかにすることができます。観察可能な影響は微妙な場合があり、一部の方法では遺伝子の「ノックダウン」（発現の減少）と「ノックアウト」（発現の排除）を区別できます。^[49] RNA干渉技術は、機能ゲノミクスにおいて最も広く利用されている技術の一つとして最近注目されています。^[50]小さなRNAを用いて開発されたスクリーニングは、細胞分裂、アポトーシス、脂肪調節などの基本的なプロセスに関与する遺伝子を特定するために使用されてきました。

少なくとも2000年代半ば以降、生物医学的および治療的用途のための低分子干渉RNAの開発への関心が高まっています。^[51]この関心を後押ししているのは、ウイルス感染から癌、神経変性疾患に至るまでのさまざまな疾患と闘うための低分子RNAの臨床的可能性と安全性を実証した実験の増加です。^[52] 2004年に、米国食品医薬品局にsiRNAの最初の治験薬申請が提出されました。これは加齢性黄斑変性症の治療薬として意図されていました。^[50]試験管内および生体内でのRNAサイレンシングは、ウイルスでの発現またはオリゴヌクレオチドの合成を介してトリガー（RNAiを誘導する核酸）を作成することによって達成されています。^[53]多くの研究は、楽観的に、小分子/薬理学的治療やワクチン/生物学的治療が過去に失敗したか、効果が低かった病原体や疾患に対して、小RNAベースの治療法が新しく強力な武器となる可能性があることを示唆しています。^[51]しかし、安全性と有効性を確保するために、小RNAエフェクター分子の設計と送達は慎重に検討する必要があるとも警告されています。

治療、臨床医学、診断におけるRNAサイレンシングの役割は急速に発展している領域であり、今後数年のうちに、この技術を使用した化合物のいくつかが市場承認に達すると予想されています。RNAサイレンシングがますます重要な役割を果たしている多くの臨床領域を強調するために、以下のレポートが要約されています。その中でも主なものは、眼および網膜疾患、癌、腎疾患、LDL低下、抗ウイルスです。^[53]次の表は、現在臨床試験のさまざまな段階にあるRNAiベースの治療法のリストを示しています。これらの試験の状況は、国立衛生研究所（NIH）のサービスであるClinicalTrials.gov Webサイトで監視できます。 ^[54]注目すべきは、臨床開発に到達した最初の化合物の中にあった、眼および網膜疾患のための開発中の治療法です。 AGN211745 (sirna027) (Allergan) および bevasiranib (Cand5) (Opko) は、加齢黄斑変性症の治療薬として臨床開発されましたが、化合物が市場に出る前に試験は中止されました。眼疾患の治療薬として開発中の他の化合物には、SYL040012 (Sylentis) および QPI-007 (Quark) があります。SYL040012 (バモシナーン) は、眼圧上昇を伴うことが多い進行性視神経変性症である緑内障の治療薬候補で、臨床開発中です。QPI-007 は、閉塞隅角緑内障および非動脈炎性前部虚血性視神経症の治療薬候補で、両化合物とも現在第 II 相臨床試験が行われています。がんや希少疾患などの疾患の治療薬として開発中の化合物もいくつかあります。

従来の製造薬と同様に、RNAi ベースの薬の派生薬を成功させる上での主な課題は、体内の必要な場所に RNAi トリガーを正確に送達することです。黄斑変性症の解毒剤が他の病気の解毒剤よりも早く成功した理由は、眼球がほぼ閉鎖系であり、血清を必要な場所に正確に針で注入できるためです。将来成功する薬は、おそらくナノボットの助けを借りて、必要な場所に着地できる薬になるでしょう。以下は、RNAi トリガーの送達の既存の手段を示す 表^{[53]の表現です。}

科学界は、RNA サイレンシングを研究ツールとしてすぐに活用してきました。mRNA を戦略的に標的とすることで、遺伝子の機能とそのオン/オフの能力に関する大量の情報が得られます。誘導 RNA サイレンシングは、遺伝子発現を抑制するための制御された方法として役立ちます。この機構はほとんどの真核生物で保存されているため、これらの実験はさまざまなモデル生物にうまく適用できます。^[55]実際には、合成ショートヘアピン RNA を発現させることで、安定したノックダウンを達成できます。^[56]プロモーターを使用してこれらのデザイナーショートヘアピン RNA を発現させることができれば、in vitro と in vivo の両方で強力で安定した制御された遺伝子ノックダウンが得られることがよくあります。^[57]ショートヘアピン RNA ベクターシステムは、cDNA 過剰発現システムの使用とほぼ同じ範囲にあると考えられます。^[58]全体として、合成および天然の小さな RNA は、細胞だけでなく動物でも遺伝子機能を研究するための重要なツールであることが証明されています。^[59]

バイオインフォマティクスによる小型RNAとその標的の同定では、植物、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ヒトの遺伝子発現に影響を与えると予測される小型RNA候補が数百、場合によっては数千個も得られている。^[60]これらの方法は主にノックアウト実験用の小型RNA候補の同定を目的としているが、より幅広い用途があるかもしれない。あるバイオインフォマティクスのアプローチでは、種子の相補的標的結合部位をフィルタリングすることで配列保存基準を評価した。引用された研究では、哺乳類遺伝子の約3分の1が、この場合miRNAによって制御されると予測された。^[61]

RNAサイレンシングの考慮すべき点の1つは、そのオフターゲット効果、毒性、および送達方法です。RNAサイレンシングが従来の薬になるためには、まずバイオメディカルの典型的な倫理的問題を乗り越えなければなりません。^[62]研究者はリスク・ベネフィット分析を使用して、RNAサイレンシングが非害悪、善行、自律性などの倫理的イデオロギーに準拠しているかどうかを判断できます。^[63]

同意のない人々に感染する可能性のある感染能力のあるウイルスが作られるリスクがあります。^[64]これらの治療法に基づいて将来の世代に影響を及ぼすリスクもあります。自律性に関して、これら2つのシナリオは非倫理的である可能性があります。現時点では、安全でない送達方法とベクターウイルスの意図しない側面が、RNAサイレンシングに反対する議論に加わっています。^[63]

オフターゲット効果に関しては、siRNAは自然インターフェロン反応を誘導し、飽和により内因性miRNAを阻害し、他の非標的mRNAと相補的な配列を持つ可能性があります。これらのオフターゲットは、がん遺伝子や抗アポトーシス遺伝子などの標的の上方制御も持つ可能性があります。RNAサイレンシングの毒性は、矛盾する報告があるため、まだ検討中です。^{[63] [64] [65]}

RNAサイレンシングは急速に発展しているため、倫理的問題についてさらに議論する必要があります。一般的な倫理原則の知識に基づいて、リスクとベネフィットの分析を継続的に実行する必要があります。^[63]

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