デノボペプチドシーケンシング

質量分析法において、デノボペプチド配列決定法は、タンデム質量分析法からペプチド アミノ酸配列を決定する方法です。

タンパク質消化物からペプチドのアミノ酸配列を知ることは、タンパク質の生物学的機能を研究するために不可欠です。昔は、これはエドマン分解法によって達成されていました。^[1]今日では、タンデム質量分析計による分析は、ペプチドの配列決定を解決するためのより一般的な方法です。一般的に、データベース検索とデノボ配列決定の2つのアプローチがあります。データベース検索は、未知のペプチドの質量スペクトルデータが送信され、既知のペプチド配列との一致を見つけるために実行される単純なバージョンであり、最も高い一致スコアを持つペプチドが選択されます。^[2]このアプローチでは、データベース内の既存の配列としか一致できないため、新しいペプチドを認識できません。デノボ配列決定は、質量スペクトルからのフラグメントイオンの割り当てです。解釈にはさまざまなアルゴリズム^[3] が使用され、ほとんどの機器にはデノボ配列決定プログラムが付属しています。

ペプチドは陽イオンモードでプロトン化されます。プロトンは最初N末端または塩基性残基側鎖に位置しますが、内部溶媒和のため、バックボーンに沿って移動し、異なる部位で切断され、異なるフラグメントが生成されます。フラグメント化のルールはいくつかの出版物でよく説明されています。^{[4] [5] [6] [7] [8] [9]}

3 種類の異なるバックボーン結合を切断してペプチド断片を形成できます。アルキルカルボニル (CHR-CO)、ペプチドアミド結合 (CO-NH)、およびアミノアルキル結合 (NH-CHR) です。^{[引用が必要]}

バックボーン結合が切断されると、図1に示すように6つの異なるタイプの配列イオンが形成される。N末端荷電フラグメントイオンはa、b、cに分類され、C末端荷電フラグメントイオンはx、y、zに分類される。下付き文字nはアミノ酸残基の数である。この命名法は最初にRoepstorffとFohlmanによって提案され、その後Biemannによって修正され、これが最も広く受け入れられたバージョンとなった。^{[11] [12]}

これらの配列イオンのうち、a、b、yイオンは、特に低エネルギー衝突誘起解離（CID）質量分析計において最も一般的なイオンタイプです。これは、ペプチドアミド結合（CO-NH）が最も脆弱であり、bイオンからのCOが失われるためです。

bイオンの質量 = Σ (残基の質量) + 1 (H ⁺ )

yイオンの質量 = Σ（残留質量）+ 19（H ₂ O+H ⁺）

aイオンの質量 = bイオンの質量 - 28 (CO)

二重骨格開裂により、H ₂ N-CHR ² -CO-NH-CHR ³ -CO+のようなアシル型またはH ₂ N-CHR ² -CO-NH ⁺ =CHR ³のようなイモニウム型の内部イオンが生成されます。これらのイオンは通常、スペクトルを乱します。

高エネルギーCID下ではC末端残基の側鎖でさらなる切断が起こり、dn _、 vn _、 wn_イオンが形成される。^[8]

フラグメントイオンのほとんどはbイオンまたはyイオンです。bイオンからCOが失われることでaイオンも頻繁に見られます。^[9]

高エネルギーCIDによって サテライトイオン（w _n、v _n、d _{nイオン）が形成されます。}

Ser、Thr、Asp、Gluを含むイオンは、中性分子の水損失を引き起こします（-18）。

Asn、Gln、Lys、Argを含むイオンは、アンモニアの中性分子損失を生成する（-17）。

Arg からのアンモニアの中性損失により、対応するイオンよりも存在量の多いフラグメントイオン (y-17) または (b-17) イオンが生成されます。

C末端に塩基性残基がある場合、ペプチドは（b _n-1 +18）イオンを生成します。

多価イオンのスペクトルでは、相補的な BY イオンペアが観察されます。この BY イオンペアの場合、下付き文字の合計は、未知のペプチドのアミノ酸残基の総数に等しくなります。

C 末端が Arg または Lys の場合、それを証明する y ₁イオンがスペクトル内に見つかります。

低エネルギー衝突誘起解離（CID）では、bイオンとyイオンが主な生成イオンです。さらに、RKNQアミノ酸を含むフラグメントでは、アンモニア（-17 Da）の損失が観察されます。STEDアミノ酸を含むフラグメントでは、水の損失（-18 Da）が観察されます。スペクトルにはサテライトイオンは表示されません。^{[引用が必要]}

高エネルギー CID では、あらゆる種類のフラグメントイオンを観察できますが、アンモニアや水の損失はありません。^{[引用が必要]}

電子移動解離（ETD）と電子捕獲解離（ECD）では、主なイオンはc、y、z+1、z+2であり、時にはwイオンである。^{[引用が必要]}

MALDIのポストソース崩壊 (PSD) では、a、b、y イオンが最も一般的な生成イオンです。^{[引用が必要]}

断片化に影響を与える要因は、電荷状態（電荷状態が高いほど、断片化に必要なエネルギーは少なくなります）、ペプチドの質量（質量が大きいほど、必要なエネルギーは多くなります）、誘導エネルギー（エネルギーが高いほど、より多くの断片化につながります）、一次アミノ酸配列、解離モード、衝突ガスです。^{[引用が必要]}

解釈のために、^[14]まず、単一アミノ酸のイモニウムイオン（H ₂ N ⁺ =CHR ²）を探します。アミノ酸に対応するイモニウムイオンは表1に示されています。スペクトルの高質量端にあるいくつかのピークは無視してください。これらは、 [M+H] ^{+イオンから中性分子の損失（H} ₂ O、NH ₃、CO ₂、HCOOH）を受けるイオンです。bイオンはCOの損失によってaイオンを形成できるため、28 Daでの質量差を見つけます。スペクトルの低質量端にあるb _{2イオンを探します。これは、y n-2}イオンの識別にも役立ちます。b _{2イオンの質量は、b 2}イオンと等しい質量を持つ単一アミノ酸とともに表2に示されています。 ^{[15] b} ₂イオンの質量= 2つのアミノ酸残基の質量 + 1。

同じ質量差で配列イオンシリーズを識別します。これはアミノ酸残基の質量の 1 つと一致します (表 1 を参照)。たとえば、 a _nと a _n-1、 b _nと b _n-1、 c _nと c _n-1の質量差は同じです。スペクトルの高質量端でy _{n-1イオンを識別します。次に、質量差をアミノ酸残基の質量と一致させて、 y n-2}、 y _n-3 ... イオンを識別します (表 1 を参照)。識別された y イオンに対応する b イオンを探します。b+y イオンの質量は、ペプチドの質量 +2 Da です。y イオン シリーズと b イオン シリーズを識別した後、アミノ酸配列を割り当てて質量を確認します。もう 1 つの方法は、最初に b イオンを識別してから、対応する y イオンを見つけることです。^{[引用が必要]}

手動の de novo シーケンスは手間がかかり、時間がかかります。通常、質量分析計に付属のアルゴリズムまたはプログラムがスペクトルの解釈に適用されます。

古くからある方法は、質量スペクトル中の前駆体イオンの可能性のあるペプチドをすべてリストし、各候補の質量スペクトルを実験スペクトルと一致させることです。最も類似したスペクトルを持つ可能性のあるペプチドは、正しい配列である可能性が最も高くなります。ただし、可能性のあるペプチドの数は多い場合があります。たとえば、分子量774の前駆体ペプチドには、21,909,046の可能性のあるペプチドがあります。これはコンピューターで行われますが、時間がかかります。^{[17] [18]}

もう一つの方法は「サブシーケンシング」と呼ばれ、可能性のあるペプチドの全配列をリストする代わりに、完全なペプチドの一部のみを表すペプチドの短い配列を一致させる。実験スペクトルのフラグメントイオンと高度に一致する配列が見つかった場合、最も一致するものを見つけるために残基ごとに1つずつ拡張される。^{[19] [20] [21] [22]}

3番目の方法では、データのグラフィカル表示が適用され、1つのアミノ酸残基の同じ質量差を持つフラグメントイオンが線で接続されます。この方法では、同じタイプのイオンシリーズの明確な画像を取得しやすくなります。この方法は、手動のde novoペプチドシーケンスには役立ちますが、ハイスループット条件では機能しません。^[23]

4番目の方法は、成功していると考えられているグラフ理論です。グラフ理論をデノボペプチドシーケンシングに適用することは、Bartelsによって初めて言及されました。^[24]スペクトルのピークは、「スペクトルグラフ」と呼ばれるグラフの頂点に変換されます。2つの頂点が1つまたは複数のアミノ酸の同じ質量差を持つ場合、有向エッジが適用されます。SeqMSアルゴリズム、^[25] Lutefiskアルゴリズム、^[26] Sherengaアルゴリズム^[27]は、このタイプの例です。

最近では、ディープラーニング技術が de novo ペプチド配列決定問題の解決に適用されています。最初のブレークスルーは DeepNovo で、畳み込みニューラルネットワーク構造を採用し、配列精度の大幅な向上を達成し、データベースを利用せずに完全なタンパク質配列アセンブリを可能にしました^{[28]その後、PointNet (PointNovo [29]} ) などの追加のネットワーク構造が、生のスペクトルから特徴を抽出するために採用されました。 de novo ペプチド配列決定問題は、配列予測問題として捉えられます。以前に予測された部分ペプチド配列が与えられると、ニューラルネットワークベースの de novo ペプチド配列決定モデルは、予測されたペプチドの質量が前駆体質量と一致するまで、最も可能性の高い次のアミノ酸を繰り返し生成します。推論時には、ビーム検索などの検索戦略を採用して、計算コストを低く抑えながら、より広い検索空間を探索できます。以前の方法と比較して、ニューラルネットワークベースのモデルは、大幅に優れた精度と感度を示しています。^{[28] [29] [30]}さらに、慎重なモデル設計により、ディープラーニングベースのde novoペプチドシーケンシングアルゴリズムは、リアルタイムのペプチドde novoシーケンシングを実現するのに十分な速度を実現できます。^[29] PEAKSソフトウェアは、このニューラルネットワーク学習をde novoシーケンシングアルゴリズムに組み込んでいます。

2012年にAndreottiらが説明したように、^[31] Antilopeはラグランジュ緩和法とYenのk最短経路の適応を組み合わせたものです。これは「スペクトルグラフ」法に基づいており、さまざまなスコアリング関数が含まれており、実行時間と精度の点で「人気のある最先端プログラム」であるPepNovoやNovoHMMに匹敵します。

Grossmannら^[32]は、シグナルピークとノイズピークを認識できる前処理モジュールを含む自動化されたde novoペプチドシーケンシングツールとしてAUDENSを2005年に発表した。

Lutefisk は、CID 質量スペクトルから de novo シーケンスを解くことができます。このアルゴリズムでは、まず重要なイオンが見つかり、次に N 末端と C 末端の証拠リストが決定されます。シーケンス リストに基づいて、スペクトル内の完全なシーケンスが生成され、実験スペクトルでスコア付けされます。ただし、結果にはわずかな違いしかないシーケンス候補がいくつか含まれる場合があり、正しいペプチド シーケンスを見つけるのは困難です。2 番目のプログラムである CIDentify は、Bill Pearson の FASTA アルゴリズムを Alex Taylor が修正したバージョンであり、不確かな類似候補を区別するために使用できます。^{[引用が必要]}

Moらは2007年にMSNovoアルゴリズムを発表し、それが「複数のデータセットで既存のde novoツールよりも優れている」ことを証明しました。^[33]このアルゴリズムは、LCQ、LTQ質量分析計および単一、二重、三重に帯電したイオンのde novoシーケンス解釈を行うことができます。他のアルゴリズムとは異なり、新しいスコアリング関数を適用し、スペクトルグラフの代わりに質量配列を使用します。

フィッシャーら^[34]は、 de novoシーケンシングのNovoHMM法を提案した。ベイジアンフレームワークでde novoシーケンシングを解決するための新しい方法として、隠れマルコフモデル（HMM）が適用されている。シーケンスの単一シンボルにスコアを付ける代わりに、この方法ではアミノ酸の事後確率を考慮する。論文では、この方法がPepNovoのような他の一般的なde novoペプチドシーケンシング方法よりも優れたパフォーマンスを持つことが、多くのサンプルスペクトルによって証明されている。

PEAKSはペプチド質量スペクトルの解釈のための完全なソフトウェアパッケージです。このソフトウェアには、デノボシーケンシング、データベース検索、PTM識別、相同性検索、およびデータ分析における定量化が含まれています。Maらは、PEAKSのデノボシーケンシングのための新しいモデルとアルゴリズムを説明し、四重極 飛行時間型（Q-TOF）質量分析計を使用して、標準タンパク質のいくつかのトリプシンペプチドの性能をLutefiskと比較しました。^[35]

PepNovoは高スループットのde novoペプチドシーケンシングツールであり、スコアリング方法として確率ネットワークを使用します。通常、1つのスペクトルの解釈には0.2秒もかかりません。Frankらによって説明されているように、 PepNovoはSherenga、PEAKS、Lutefiskなどのいくつかの一般的なアルゴリズムよりも優れています。^[36]現在、新しいバージョンのPepNovo+が利用可能です。

Chiらは、補完的なHCDとETDタンデム質量スペクトルを使用した新しいde novoペプチドシーケンシングツールとして2013年にpNovo+を発表しました。^[37]この方法では、コンポーネントアルゴリズムpDAGにより、ペプチドシーケンシングの取得時間が平均0.018秒に大幅に短縮され、これは他の一般的なde novoシーケンシングソフトウェアの3倍の速さです。

Jeongらが述べているように、特定の種類のスペクトルにしか対応していない他のdo novoペプチドシーケンシングツールと比較して、UniNovoはより汎用的なツールであり、CID、ETD、HCD、CID / ETDなどのさまざまな種類のスペクトルやスペクトルペアで優れたパフォーマンスを発揮します。PepNovo +やPEAKSよりも精度が優れています。さらに、報告されたペプチド配列のエラー率を生成します。^[38]

マー氏は2015年にリアルタイムのデノボペプチドシーケンシングエンジンとしてNovorを発表しました。このツールはデノボ速度を1桁向上させ、市場の他のデノボツールと同様の精度を維持することを目指しています。Macbook Proラップトップでは、Novorは1秒あたり300以上のMS/MSスペクトルを達成しました。^[39]

Pevtsovらは、上記5つのde novoシーケンスアルゴリズム（AUDENS、Lutefisk、NovoHMM、PepNovo、およびPEAKS）のパフォーマンスを比較しました。QSTARおよびLCQ質量分析計データが分析に使用され、動的計画法によって計算されたde novoペプチドシーケンスと実際のペプチドシーケンスとの類似性である相対シーケンス距離（RSD）値によって評価されました。結果は、すべてのアルゴリズムがLCQデータよりもQSTARデータで優れたパフォーマンスを示した一方で、最高のPEAKSはQSTARデータで49.7％の成功率を示し、最高のNovoHMMはLCQデータで18.3％の成功率を示しました。QSTARデータでのパフォーマンスの順序は、PEAKS > Lutefisk、PepNovo > AUDENS、NovoHMMであり、LCQデータではNovoHMM > PepNovo、PEAKS > Lutefisk > AUDENSでした。スペクトル品質の範囲で比較すると、PEAKSとNovoHMMは5つのアルゴリズムの中で両方のデータで最高のパフォーマンスを示しました。PEAKSとNovoHMMはQSTARとLCQデータの両方で最高の感度を示しました。しかし、評価されたアルゴリズムはどちらのデータセットでも50％を超える正確な識別率を達成しませんでした。^[40]

質量分析計の最近の進歩により、超高解像度の質量スペクトルを生成することが可能になった [1]。精度の向上と、生成される質量分析データの増加により、ディープラーニング技術を de novo ペプチドシーケンシングに適用することへの関心が高まっている。2017 年に Tran らは、ディープラーニング ベースの最初の de novo シーケンシング ソフトウェアである DeepNovo を提案した。元の論文のベンチマーク分析では、DeepNovo が PEAKS、Novor、PepNovo などの従来の方法を大幅に上回る性能を示した。DeepNovo は、Tensorflow フレームワークを使用して Python で実装されている。^[41]質量スペクトルをニューラル ネットワークへの固定次元入力として表現するために、DeepNovo は各スペクトルを長さ 150,000 のベクトルに離散化しました。この不必要に大きなスペクトル表現と、元の実装でのシングル スレッド CPU 使用率により、DeepNovo はペプチドシーケンシングをリアルタイムで実行することができません。デノボペプチドシーケンシングモデルの効率をさらに向上させるために、Qiaoらは2020年にPointNovoを提案しました。PointNovoはPyTorchフレームワーク^[42]で実装されたPythonソフトウェアであり、DeepNovoが採用したスペースを消費するスペクトルベクトル表現を排除します。DeepNovoと比較して、PointNovoはスペクトルをm/zと強度のペアのセットとして直接表現することで、より優れた精度と効率を同時に達成することができました。^[要出典]