配列分析

バイオインフォマティクスにおける配列解析とは、DNA、RNA、ペプチド配列をさまざまな分析方法にかけ、その特徴、機能、構造、進化を理解するプロセスです。生物のゲノム全体、トランスクリプトーム、プロテオームに対して実行することも、タンデムリピートや転移因子などの特定のセグメントや領域のみを対象にすることもできます。使用される方法論には、配列アライメント、生物学的データベースに対する検索などがあります。^[1]

遺伝子およびタンパク質配列のハイスループット生成法の開発以来、データベースへの新しい配列の追加率は急速に増加しました。このような配列のコレクションは、それ自体では科学者の生物の生物学に対する理解を深めるものではありません。しかし、これらの新しい配列を既知の機能を持つ配列と比較することは、新しい配列の由来となった生物の生物学を理解するための重要な方法です。したがって、配列分析は、通常、配列を比較して類似点と相違点を調べることにより、生物学的配列のコーディング領域と非コーディング領域に機能を割り当てるために使用できます。今日では、配列比較 (配列アライメント) を提供し、アライメント製品を分析してその生物学を理解するツールと技術が数多くあります。

分子生物学における配列解析には、非常に幅広いプロセスが含まれます。

1. 類似性を見つけるために配列を比較し、多くの場合、それらが関連しているかどうか（相同性）を推測する。
2. 活性部位、翻訳後修飾部位、 遺伝子構造、読み枠、イントロンとエクソンの分布、調節要素などの配列の固有の特徴の特定
3. 遺伝子マーカーを取得するために、点突然変異や一塩基多型(SNP)などの配列の違いや変異を識別します。
4. 配列と生物の進化と遺伝的多様性を明らかにする
5. 配列のみから分子構造を同定します。

1951年にフレッド・サンガーがインスリンタンパク質の最初の配列を特徴付けて以来、生物学者はこの知識を利用して分子の機能を理解しようとしてきました。 ^{[2] [3]}彼と彼の同僚の発見は、最初のDNAベースのゲノムの配列決定の成功に貢献しました。^[4]この研究で使用された方法は、「サンガー法」またはサンガー配列決定と呼ばれ、DNAなどの長鎖分子の配列決定におけるマイルストーンでした。この方法は最終的にヒトゲノムプロジェクトで使用されました。^[5]マイケル・レビット によると、配列分析は1969年から1977年の間に生まれました。^{[6] 1969年に、}転移RNAの配列の分析を使用して、ヌクレオチド配列の相関変化から残基の相互作用を推測し、tRNAの二次構造のモデルを生み出しました。^[7] 1970年、ソール・B・ニードルマンとクリスチャン・D・ヴンシュは、2つの配列を整列させる最初のコンピュータアルゴリズムを発表しました。^[8]この間、ヌクレオチド配列を取得する開発は大きく進歩し、1977年にバクテリオファージの最初の完全なゲノムが公開されました。 ^[9]ロバート・ホーリーとコーネル大学の彼のチームは、RNA分子の配列を最初に決定したと考えられています。^[10]

ヌクレオチド配列解析は、タンパク質結合部位などの機能要素を特定し、SNP などの遺伝的変異を明らかにし、遺伝子発現パターンを研究し、形質の遺伝的基礎を理解します。これは、複製や転写などのプロセスに寄与するメカニズムを理解するのに役立ちます。関連するタスクの一部を以下に概説します。

品質管理は、シーケンシング技術（例えば、イルミナ）から得られたシーケンシングリードの品質を評価する。これは、品質の悪いデータによる誤った結論を制限するためのシーケンス解析の最初のステップである。この段階で使用されるツールは、シーケンシングプラットフォームによって異なります。たとえば、FastQCは短いリード（RNAシーケンスを含む）の品質をチェックし、NanoplotまたはPycoQCは長いリードシーケンス（例えば、ナノポアシーケンスリード）に使用され、MultiQCはFastQCの結果をウェブページ形式で集約します。^{[11] [12] [13]}

品質管理では、リード長、GC含有量、アダプター配列の存在（短いリードの場合）、品質スコアなどの情報が提供され、品質スコアはPHREDスケールで表されることが多い。^{[14]アダプターやPCR増幅によるその他のアーティファクトがリード（特に短いリード）に存在する場合、Trimmomatic [15]やCutadapt [16]}などのソフトウェアを使用して除去される。

このステップでは、品質が向上したシーケンスリードは、短いDNAシーケンスリードの場合はBWA ^{[17] 、長いリードDNAシーケンスの場合はミニマップ[18]}、RNAシーケンスリードの場合はSTAR ^[19]などのアライメントツールを使用して、リファレンスゲノムにマッピングされます。マッピングの目的は、リファレンスシーケンスに基づいて任意のリードの起源を見つけることです。また、変異の検出や系統発生研究にも重要です。このステップの出力、つまりアライメントされたリードは、SAMと呼ばれる互換性のあるファイル形式で保存されます。このファイルには、リファレンスゲノムと個々のリードに関する情報が含まれています。代わりに、デスクやストレージスペースをあまり使用しないBAMファイル形式が好まれます。 ^[14]

注: これは、2 つ以上の配列全体 (または配列領域) を比較して類似性や相違点を定量化したり、未知の配列を識別したりする配列アライメントとは異なります (以下で説明)。

以下の分析手順は DNA 配列に特有です。

変異の特定は配列解析の一般的な側面です。変異には、感染症における薬剤耐性のメカニズムを説明するなど、生物学的に重要な情報が含まれていることが多いためです。これらの変異には、一塩基変異（SNV）、小さな挿入/削除（インデル）、大きな構造変異などがあります。リードアラインメントはSAMtoolsを使用してソートされ、その後、GATK ^[20]などの変異呼び出しツールが参照配列と比較した違いを識別するために使用されます。

変異呼び出しツールの選択は、使用されるシーケンス技術に大きく依存するため、短い読み取りを扱う場合はGATKがよく使用され、長い読み取りシーケンスにはDeepVariant ^[21]やSniffles ^[22]などのツールが必要です。ツールは、生物（原核生物または真核生物）、シーケンスデータのソース（がんまたはメタゲノム）、および興味のある変異タイプ（SNVまたは構造変異）に基づいても異なる場合があります。変異呼び出しの出力は通常vcf形式であり、アレル頻度、品質スコア、または手元の研究課題に基づくその他の要因を使用してフィルタリングできます。^[14]

このステップでは、査読済み論文やgnomADやEnsemblなどの公開データベースからキュレーションされた情報を使用して、変異データにコンテキストを追加します。ANNOVARやSnpEffなどのツール、 ^[23] 、またはカスタムスクリプトとパイプラインを使用して、ゲノムの特徴、機能的結果、調節要素、および集団頻度に関する情報で変異に注釈を付けることができます。このステップからの出力は、bedまたはtxt形式の注釈ファイルです。^[14]

リードアラインメント、カバレッジプロット、バリアントコールなどのゲノムデータは、 IGV（Integrative Genomics Viewer）やUCSC Genome Browserなどのゲノムブラウザを使用して視覚化できます。結果の解釈は、調査中の生物学的な質問や仮説の文脈で行われます。出力は、Circosプロット、火山プロットなどの形式でのデータのグラフィカル表現、または観察を説明する他の形式のレポートになります。^[14]

DNA 配列分析には、関係性を推測するための統計モデリングや、DSS などのツールを使用して異なるメチル化領域を特定するなどのエピジェネティック分析も含まれる可能性があります。

次の手順は RNA 配列に特有です。

マップされたRNA配列は、HTSeqなどの定量化ツールを使用して遺伝子発現レベルを推定するために分析され、^{[24] 、} DESeq2などの統計的手法を使用して実験条件間で差次的に発現する遺伝子（DEG）を特定します。^[25]これは、異なるサンプル間またはサンプル間で遺伝子またはアイソフォームの発現レベルを比較し、生物学的関連性を推測するために実行されます。^[14] 遺伝子発現解析の出力は通常、行に遺伝子IDまたは名前、列にサンプルの発現レベルを表す値、および標準誤差とp値を含む表です。 表の結果は、ボルケーノプロットとヒートマップを使用してさらに視覚化でき、色は推定発現レベルを表します。 Rのggplot2やPythonのMatplotlibなどのパッケージは、ビジュアルを作成するためによく使用されます。 表には、参照注釈ファイル（通常はGTFまたはGFF形式）を使用して注釈を付けることもできます。これにより、染色体名、ストランド、開始位置、位置など、遺伝子に関する詳細なコンテキストが提供され、結果の解釈に役立ちます。^{[14] [12] [13] [26]}

機能エンリッチメント解析では、前のステップで得られた差次的に発現した遺伝子に関連する生物学的プロセス、経路、機能的影響を特定します。この解析では、GOSeq ^[27]や Pathview ^[28]などのツールを使用します。これにより、差次的に発現した遺伝子に関連する経路と分子プロセス、ダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションされている遺伝子、および遺伝子オントロジーのどの用語が繰り返し出現または過剰に表現されているかに関する情報を含む表が作成されます。^{[14] [12] [13] [26]}

RNA 配列解析は、生物学的プロセスと疾患の根底にある遺伝子発現のダイナミクスと制御メカニズムを調査します。画像と表の解釈は、調査対象の仮説のコンテキスト内で実行されます。

参照:トランスクリプトミクス技術。

プロテオーム配列解析は、特定の条件下で生物または細胞によって発現されるタンパク質の完全なセットを研究します。タンパク質の構造、機能、翻訳後修飾、および生物システム内の相互作用を説明します。多くの場合、mzML、mzXML、またはRAWファイル形式のプロテオミクス実験からの生の質量分析（MS）データから始まります。^[14]

生の MS データを前処理してノイズを除去し、強度を正規化し、ピークを検出し、独自のファイル形式 (例: RAW) をオープンソース形式 (mzML、mzXML) に変換して下流の分析ツールとの互換性を確保する以外に、ペプチドの同定、ペプチドの定量、タンパク質の推定と定量、品質管理レポートの生成、正規化、補完、有意性検定などの分析手順があります。分析手順の選択と順序は、使用する MS 方法 (データ依存取得 (DDA) または独立取得 (DIA)) によって異なります。^{[14] [29]}

ゲノムブラウザは、ゲノムとゲノムセグメントを視覚化し、ゲノムの特徴を識別し、多数のゲノム要素間の関係を分析するための、コード不要でユーザーフレンドリーなインターフェースを提供します。3つの主要なゲノムブラウザ、Ensemblゲノムブラウザ、UCSCゲノムブラウザ、国立生物工学情報センター（NCBI）は、ゲノムアセンブリ、ゲノムアノテーション、および差異的発現パターンの探索や保存領域の特定などの比較ゲノムを含む、さまざまなシーケンス解析手順をサポートしています。すべてのブラウザは、アップロードとダウンロード用の複数のデータ形式をサポートし、シーケンス解析用の外部ツールとリソースへのリンクを提供し、その汎用性に貢献しています。^{[30] [31]}

タンパク質とヌクレオチドの配列は数百万種知られています。これらの配列は、タンパク質ファミリーまたは遺伝子ファミリーと呼ばれる多くの関連配列グループに分類されます。これらの配列間の関係は通常、配列を整列させてスコアを割り当てることによって発見されます。配列アライメントには主に 2 つの種類があります。ペアワイズ配列アライメントでは一度に 2 つの配列のみを比較し、多重配列アライメントでは多数の配列を比較します。配列のペアを整列させる 2 つの重要なアルゴリズムは、Needleman-Wunsch アルゴリズムとSmith-Waterman アルゴリズムです。配列アライメントの一般的なツールには、次のものがあります。

• ペアワイズアライメント - BLAST、ドットプロット
• 多重アライメント - ClustalW、PROBCONS、MUSCLE、MAFFT、 T-Coffee。

ペアワイズ配列アライメントの一般的な用途は、関心のある配列を取得し、それをデータベース内のすべての既知の配列と比較して、相同配列を特定することです。一般に、データベース内の一致は、最も関連性の高い配列が最初に表示され、その後に類似性が低下する配列が表示されるように順序付けられます。これらの一致は通常、期待値などの統計的有意性の尺度とともに報告されます。

1987年、マイケル・グリブスコフ、アンドリュー・マクラクラン、デビッド・アイゼンバーグは、タンパク質間の遠い類似性を識別するためのプロファイル比較の方法を導入しました。^[32]プロファイル法では、単一の配列を使用するのではなく、複数の配列アライメントを使用して、各残基の保存レベルに関する情報を含むプロファイルをエンコードします。これらのプロファイルを使用して、配列のコレクションを検索し、関連する配列を見つけることができます。プロファイルは、位置固有スコアリングマトリックス（PSSM）としても知られています。1993年、アンダース・クロウと同僚は、隠れマルコフモデルを使用して、プロファイルの確率的解釈を導入しました。^{[33] [34]}これらのモデルは、プロファイルHMMとして知られるようになりました。

近年、^{[いつ? ]}プロファイル同士を直接比較できる方法が開発されました。これらはプロファイル-プロファイル比較法として知られています。^[35]

配列アセンブリとは、小さな DNA 断片を整列させて結合することで DNA 配列を再構築することを指します。これは現代のDNA 配列決定に不可欠な部分です。現在利用可能な DNA 配列決定技術は長い配列の読み取りには適していないため、大きな DNA 断片 (ゲノムなど) は、(1) DNA を小さな断片に切断し、(2) 小さな断片を読み取り、(3) さまざまな断片の情報を結合して元の DNA を再構成することによって配列決定されることがよくあります。

最近では、一度に複数の種の配列を決定することが主要な研究目標の1つになっています。メタゲノミクスは、環境から直接採取された微生物群集の研究です。研究室で培養された微生物とは異なり、野生サンプルには通常、元の生息地からの数十、時には数千種類の微生物が含まれています。^[36]元のゲノムを回復することは非常に困難です。

遺伝子予測または遺伝子発見とは、遺伝子をコードするゲノム DNA の領域を特定するプロセスを指します。これには、タンパク質コード遺伝子とRNA 遺伝子が含まれますが、調節領域などの他の機能要素の予測も含まれる場合があります。遺伝子予測は、配列決定された種のゲノムを理解するための最初で最も重要なステップの 1 つです。一般に、細菌遺伝子の予測は、通常複雑なイントロン/エクソンパターンを持つ真核生物種の遺伝子の予測よりもはるかに単純で正確です。長い配列内の遺伝子の特定は、特に遺伝子数が不明な場合は問題のままです。隠れマルコフ モデルは解決策の一部となる可能性があります。^[37]機械学習は、転写因子の配列予測に重要な役割を果たしてきました。^[38]従来の配列解析は、ヌクレオチド配列自体の統計パラメータに焦点を当てていました (使用される最も一般的なプログラムを表 4.1 に示します)。別の方法は、他の既知の遺伝子配列に基づいて相同配列を特定することです (ツールについては表 4.3 を参照)。^[39] ここで説明した2つの方法は、配列に焦点を当てています。しかし、DNAやタンパク質などの分子の形状特性も研究されており、これらの分子の挙動に同等かそれ以上の影響を与えることが提案されています。^[40]

分子の 3D 構造は、自然界における分子の機能にとって非常に重要です。原子レベルでの巨大分子の構造予測は、ほとんど手に負えない問題であるため、一部の生物学者は、一次配列レベルで 3D 構造を予測する方法を導入しました。これには、局所領域のアミノ酸残基の生化学的または統計的分析、および既知の 3D 構造を持つ相同体 (または関連する可能性のある他のタンパク質) からの構造的推論が含まれます。

構造予測問題を解決するために、多種多様なアプローチが存在します。どの方法が最も効果的かを判断するために、CASP（Critical Assessment of Structure Prediction）と呼ばれる構造予測コンペティションが設立されました。^[41]

シーケンス解析タスクは解決が簡単ではないことが多く、比較的複雑なアプローチを使用する必要があります。その多くは、既存の多くのシーケンス解析ツールの基盤となっています。実際に使用されている多くの方法のうち、最も人気のあるものは次のとおりです。

• 動的プログラミング
• 人工ニューラルネットワーク
• 隠れマルコフモデル
• サポートベクターマシン
• クラスタリング
• ベイジアンネットワーク
• 回帰分析
• シーケンスマイニング
• アライメントフリー配列解析

• 配列アライメントソフトウェアのリスト
• アライメント可視化ソフトウェア一覧
• 系統解析ソフトウェア一覧
• 系統樹可視化ソフトウェア一覧
• タンパク質構造予測ソフトウェア一覧
• RNA構造予測ソフトウェア一覧
• 社会科学におけるシーケンス分析のソフトウェアセクション