タンパク質配列解析

タンパク質配列決定は、タンパク質またはペプチドの全体または一部のアミノ酸配列を決定する実際的なプロセスです。これは、タンパク質を識別したり、翻訳後修飾を特徴付けたりするために役立ちます。通常、タンパク質の部分的な配列決定により、遺伝子の概念的翻訳から得られたタンパク質配列のデータベースを参照してタンパク質を識別するのに十分な情報（1つ以上の配列タグ）が提供されます。

タンパク質配列を決定する 2 つの主要な直接法は、質量分析法とタンパク質シーケンサー (シーケンサ) を使用したエドマン分解法です。質量分析法は現在、タンパク質の配列決定と識別に最も広く使用されていますが、エドマン分解法はタンパク質のN末端を特徴付けるための貴重なツールとして今でも使用されています。

多くの場合、順序付けられた配列を見つけようとする前に、タンパク質の順序付けられていないアミノ酸組成を知っておくことが望ましい。この知識は、配列決定プロセスにおけるエラーの発見を容易にしたり、あいまいな結果を区別したりするために使用できるからである。特定のアミノ酸の頻度に関する知識は、タンパク質の消化に使用するプロテアーゼを選択するためにも使用できる。タンパク質への低レベルの非標準アミノ酸（ノルロイシンなど）の誤った取り込みも判定できる。^{[1]アミノ酸頻度を決定するための、}アミノ酸分析^[2]と呼ばれる一般的な方法は次のとおりです。

1. 既知量のタンパク質をその構成アミノ酸に加水分解します。
2. 何らかの方法でアミノ酸を分離し、定量化します。

加水分解は、タンパク質サンプルを 6 M塩酸中で100～110 °C で 24 時間以上加熱することによって行われます。多くのかさ高い疎水基を持つタンパク質では、より長い加熱時間が必要になる場合があります。ただし、これらの条件は非常に激しいため、一部のアミノ酸 (セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン、システイン) は分解されます。この問題を回避するために、Biochemistry Online では、別々のサンプルを異なる時間加熱し、それぞれの結果の溶液を分析して、加水分解時間ゼロまで外挿することを提案しています。Rastall は、トリプトファンとチロシンを塩素による攻撃から保護するためのチオール試薬やフェノール、およびシステインを事前に酸化するなど、分解を防止または軽減するためのさまざまな試薬を提案してい ます。彼はまた、発生したアンモニアの量を測定してアミド加水分解の程度を決定することを提案しています。

アミノ酸はイオン交換クロマトグラフィーで分離し、その後誘導体化して検出を容易にすることができます。より一般的には、アミノ酸は誘導体化されてから逆相 HPLCで分離されます。

イオン交換クロマトグラフィーの例として、NTRC がスルホン化ポリスチレンをマトリックスとして使用し、酸性溶液中のアミノ酸を添加し、pH が徐々に増加する緩衝液をカラムに通す方法があります。pH がそれぞれの等電点に達すると、アミノ酸が溶出されます。アミノ酸が分離されたら、色のついた誘導体を形成する試薬を添加してそれぞれの量を決定します。アミノ酸の量が 10 nmol を超える場合は、ニンヒドリンを使用できます。ニンヒドリンはプロリンと反応すると黄色になり、他のアミノ酸と反応すると鮮やかな紫色になります。アミノ酸の濃度は、結果として得られる溶液の吸光度に比例します。10 pmol までの非常に少量では、オルトフタルデヒド (OPA)やフルオレサミンなどの試薬を使用して蛍光誘導体を形成できます。

プレカラム誘導体化では、エドマン試薬を使用して、紫外線で検出される誘導体を生成します。蛍光誘導体を生成する試薬を使用すると、感度が向上します。誘導体化されたアミノ酸は、通常、C8 または C18シリカカラムと最適化された溶出勾配を使用して、逆相クロマトグラフィーにかけられます。溶出アミノ酸は、UV または蛍光検出器を使用して検出され、ピーク面積が誘導体化された標準のピーク面積と比較され、サンプル内の各アミノ酸が定量されます。

ペプチド鎖のN末端を形成するアミノ酸を特定することは、2 つの理由で有用です。1 つは、個々のペプチド断片の配列を鎖全体に整列させるのに役立つこと、もう 1 つは、エドマン分解の最初のラウンドで不純物が混入することが多く、そのためN末端アミノ酸を正確に特定できないためです。N末端アミノ酸分析 の一般的な方法は次のとおりです。

1. 末端アミノ酸を選択的に標識する試薬とペプチドを反応させます。
2. タンパク質を加水分解します。
3. クロマトグラフィーと標準物質との比較によりアミノ酸を決定します。

末端アミノ酸の標識には、さまざまな試薬が使用できます。試薬はすべてアミン基と反応するため、リジンなどのアミノ酸の側鎖のアミン基にも結合します。このため、クロマトグラムを解釈する際には、正しいスポットが選択されるように注意する必要があります。より一般的な試薬は、サンガー試薬( 1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン) とダンシル誘導体(ダンシルクロリドなど) の 2 つです。エドマン分解用の試薬であるフェニルイソチオシアネートも使用できます。アミノ酸組成の決定と同じ問題がここでも当てはまりますが、試薬は有色の誘導体を生成するため染色は不要で、必要なのは定性分析のみです。そのため、アミノ酸をクロマトグラフィーカラムから溶出させる必要はなく、標準と比較するだけで済みます。考慮すべきもう 1 つの点は、アミン基が標識試薬と反応するため、イオン交換クロマトグラフィーは使用できず、代わりに薄層クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィーを使用する必要があることです。

C 末端アミノ酸分析に利用できる方法は、 N 末端分析に利用できる方法の数よりはるかに少ないです。最も一般的な方法は、タンパク質溶液にカルボキシペプチダーゼを加え、一定間隔でサンプルを採取し、アミノ酸濃度と時間のプロットを分析することによって末端アミノ酸を決定することです。この方法は、ポリペプチドやタンパク質でブロックされた N 末端の場合に非常に役立ちます。C 末端配列決定は、DNA 配列から予測されるタンパク質の一次構造を検証し、既知のコドン配列から遺伝子産物の翻訳後処理を検出するのに大いに役立ちます。

エドマン分解は、タンパク質の配列決定にとって非常に重要な反応です。この反応により、タンパク質の整然としたアミノ酸組成を発見できるからです。自動エドマン シーケンサーは現在広く使用されており、約 50 アミノ酸までのペプチドを配列決定できます。エドマン分解によるタンパク質の配列決定の反応スキームを以下に示します。その後、いくつかの手順について詳しく説明します。

1. 2-メルカプトエタノールなどの還元剤を使用して、タンパク質内のジスルフィド結合を切断します。結合が再形成されないようにするには、ヨード酢酸などの保護基が必要になる場合があります。
2. タンパク質複合体の個々の鎖が複数ある場合は、それらを分離して精製します。
3. 各鎖のアミノ酸組成を決定します。
4. 各鎖の末端アミノ酸を決定します。
5. 各鎖を 50 アミノ酸未満の長さの断片に分割します。
6. 破片を分離して精製します。
7. 各フラグメントの順序を決定します。
8. 異なる切断パターンで繰り返します。
9. タンパク質全体の配列を構築します。

約 50 ～ 70 アミノ酸より長いペプチドは、エドマン分解では確実に配列決定できません。このため、長いタンパク質鎖は小さな断片に分解して、個別に配列決定する必要があります。分解は、トリプシンやペプシンなどのエンドペプチダーゼ、または臭化シアンなどの化学試薬によって行われます。酵素によって切断パターンは異なり、断片間の重なりを利用して全体の配列を構築できます。

配列決定するペプチドは固体表面に吸着されます。一般的な基質の1 つは、カチオン性ポリマーであるポリブレンでコーティングされたガラス繊維です。エドマン試薬であるフェニルイソチオシアネート(PITC) を、 12%トリメチルアミンの弱塩基性緩衝液とともに吸着ペプチドに加えます。これが N 末端アミノ酸のアミン基と反応します。

末端アミノ酸は、無水酸を加えることで選択的に切り離すことができます。その後、誘導体は異性化して置換フェニルチオヒダントインとなり、これを洗浄してクロマトグラフィーで識別し、サイクルを繰り返すことができます。各ステップの効率は約 98% で、約 50 種類のアミノ酸を確実に特定できます。

タンパク質シークエネーター ^[3]は、エドマン分解を自動で行う機械です。タンパク質またはペプチドのサンプルをタンパク質シークエネーターの反応容器に固定し、エドマン分解を行います。各サイクルで、タンパク質またはペプチドのN末端から1つのアミノ酸が放出され、誘導体化されます。放出されたアミノ酸誘導体は、HPLCによって識別されます。測定可能な配列全体が確立されるまで、または事前に決められたサイクル数まで、ポリペプチド全体に対してシークエンシングプロセスが繰り返し実行されます。

タンパク質の同定は、アミノ酸配列に基づいて、対象タンパク質 (POI) に名前を割り当てるプロセスです。通常、遺伝子の DNA 配列から推定されたタンパク質配列のデータベースを参照してタンパク質を同定するには、タンパク質の配列の一部のみを実験的に決定する必要があります。さらに、タンパク質の特性評価には、POI の実際の N 末端と C 末端の確認、配列バリアントの決定、存在する翻訳後修飾の特定などが含まれる場合があります。

タンパク質同定の一般的なスキームが説明されている。^{[4] [5]}

1. POI は、通常、SDS-PAGEまたはクロマトグラフィーによって分離されます。
2. 分離された POI は、システイン残基を安定化するために化学的に修飾される場合があります (例: S-アミドメチル化または S-カルボキシメチル化)。
3. POI は特定のプロテアーゼで消化され、ペプチドを生成します。リジンまたはアルギニン残基の C 末端側を選択的に切断するトリプシンは、最も一般的に使用されるプロテアーゼです。その利点には、i) タンパク質中のリジンおよびアルギニン残基の頻度、ii) 酵素の高い特異性、iii) 酵素の安定性、および iv) トリプシンペプチドの質量分析への適合性などがあります。
4. ペプチドは脱塩してイオン化可能な汚染物質を除去し、MALDI-TOF質量分析にかけることができます。ペプチドの質量を直接測定すると、タンパク質を同定するのに十分な情報が得られる可能性があります (ペプチド質量フィンガープリンティングを参照) が、ペプチドの配列に関する情報を得るために、質量分析計内でペプチドをさらに断片化することがよく使用されます。あるいは、ペプチドを脱塩して逆相 HPLCで分離し、 ESIソースを介して質量分析計に導入することもできます。LC-ESI-MS は、タンパク質の同定に関して MALDI-MS よりも多くの情報を提供できますが、機器の所要時間は長くなります。
5. 質量分析計の種類に応じて、衝突誘起解離(CID) やポストソース崩壊(PSD)などのさまざまなメカニズムを介してペプチドイオンの断片化が発生する可能性があります。いずれの場合も、ペプチドのフラグメントイオンのパターンから、その配列に関する情報が得られます。
6. 次に、推定ペプチドイオンの測定質量とそのフラグメントイオンの測定質量を含む情報が、タンパク質配列のデータベースの概念的（in-silico）タンパク質分解およびフラグメント化から計算された質量値と照合されます。スコアが分析パラメータに基づくしきい値を超えると、一致が成功します。実際のタンパク質がデータベースに表示されていない場合でも、エラー許容マッチングにより、相同タンパク質との類似性に基づいてタンパク質を推定的に識別できます。この分析を実行するためのさまざまなソフトウェア パッケージが利用可能です。
7. ソフトウェア パッケージは通常、識別された各タンパク質の ID (アクセス コード) とその一致スコアを示すレポートを生成し、複数のタンパク質が識別された場合の一致の相対的な強さの尺度を提供します。
8. 同定されたタンパク質の配列上の一致したペプチドの図は、配列カバレッジ (ペプチドとして検出されたタンパク質の割合) を示すためによく使用されます。POI が一致したタンパク質よりも大幅に小さいと考えられる場合、図は POI が同定されたタンパク質の N 末端フラグメントであるか C 末端フラグメントであるかを示唆する場合があります。

ペプチドの断片化パターンにより、de novoシーケンシングによってその配列を直接決定できます。この配列は、タンパク質配列のデータベースと照合したり、翻訳後修飾や化学修飾を調査したりするために使用できます。これは、上記のように実行されたタンパク質同定に追加の証拠を提供する可能性があります。

タンパク質同定中に一致したペプチドには、一致したタンパク質について予測された N 末端または C 末端が必ずしも含まれているわけではありません。これは、N 末端または C 末端ペプチドが MS で識別しにくい (短すぎるか長すぎるなど)、翻訳後修飾されている (N 末端のアセチル化など)、または予測と実際に異なることが原因である可能性があります。翻訳後修飾または切断された末端は、データを詳しく調べる (つまり、de novoシーケンシング) ことで特定できます。異なる特異性のプロテアーゼを使用した繰り返し消化も役立つ場合があります。

既知のタンパク質配列に基づく予測と MS データの詳細な比較は翻訳後修飾を定義するために使用できますが、データ取得に対するターゲットを絞ったアプローチも使用できます。たとえば、リン酸化ペプチドの特定の濃縮は、タンパク質のリン酸化部位の特定に役立ちます。質量分析計でのペプチド断片化の代替方法 ( ETDやECDなど) は、補完的な配列情報を提供する場合があります。

タンパク質全体の質量は、アミノ酸残基の質量と水分子の質量の合計で、翻訳後修飾を考慮して調整されます。タンパク質は、タンパク質から得られるペプチドほどイオン化されませんが、溶液中のタンパク質は ESI-MS にかけることができ、その質量を 20,000 分の 1 以上の精度で測定できます。多くの場合、これで末端を確認し (したがって、タンパク質の測定質量が配列から予測される質量と一致する)、多くの翻訳後修飾の有無を推測できます。

タンパク質分解では、POI の全配列をカバーする、分析しやすいペプチドのセットが常に生成されるわけではありません。質量分析計でのペプチドの断片化では、各ペプチド結合での切断に対応するイオンが生成されないことがよくあります。したがって、各ペプチドの推定配列は必ずしも完全ではありません。標準的な断片化方法では、ロイシン残基とイソロイシン残基は異性体であるため、区別されません。

エドマン分解はタンパク質の N 末端から進行するため、N 末端が化学的に修飾されている場合 (例: アセチル化またはピログルタミン酸の形成) は機能しません。エドマン分解は、一般にジスルフィド結合の位置を決定するのに役立ちません。また、識別可能な結果を​​得るには 1 ピコモル以上のペプチド量が必要なため、質量分析よりも感度が低くなります。

生物学では、タンパク質はメッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳によって生成され、タンパク質配列はmRNAのコドン配列から派生します。mRNA自体は遺伝子の転写によって形成され、さらに変更される可能性があります。これらのプロセスは十分に理解されており、コンピューターアルゴリズムを使用して、全ゲノムDNA配列決定プロジェクトなどのDNA配列からタンパク質配列を予測することを自動化し、UniProtなどのタンパク質配列の大規模なデータベースの生成につながっています。予測されたタンパク質配列は、質量分析によるタンパク質同定の重要なリソースです。

歴史的には、エドマン分解によって決定された短いタンパク質配列 (10 ～ 15 残基) は、対応する遺伝子または相補 DNA の分子クローンを分離するためのプローブまたはプライマーとして使用できる DNA 配列に逆翻訳されました。その後、クローン化された DNA の配列が決定され、タンパク質の完全なアミノ酸配列を推定するために使用されました。

バイオインフォマティクスツールには、質量スペクトルの解釈を支援するもの（de novoペプチド配列決定を参照）、タンパク質配列を比較または分析するもの（配列分析を参照）、ペプチドまたはタンパク質配列を使用してデータベースを検索するもの（BLASTを参照）などがあります。

タンパク質の配列決定の難しさは、自己破壊する前に正確に k 回実行されるプログラムである k 時間プログラムを作成するための基礎として最近提案されました。すべてのソフトウェアは本質的に無制限に複製できるため、このようなものを純粋にソフトウェアで構築することは不可能です。

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