単一細胞解析

シングルセルゲノミクスは、正確なシーケンスを行うための十分な統計的検出力を確保するために、細胞内のDNAコピー数を増やすことに大きく依存している。このため、全ゲノム増幅（WGA）戦略が開発されてきた。現在、WGA戦略は3つのカテゴリーに分類できる。

• 制御されたプライミングとPCR増幅：アダプターリンカーPCR WGA
• ランダムプライミングとPCR増幅：DOP-PCR、MALBAC
• ランダムプライミングと等温増幅：MDA

アダプターリンカーPCR WGAは、アレル脱落効果が非常に低いため、二倍体単一細胞変異解析において最も優れた性能を発揮する技術であると多くの比較研究で報告されており^{[ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]}、また、aCGHとNGSローパスシーケンスの両方においてノイズが低いため、コピー数変異プロファイリングにも最適である^{[ 28 ] [ 29 ]} 。この方法は、固定細胞と非固定細胞の両方を含むヒト細胞にのみ適用可能である。

広く採用されているWGA技術の1つに、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（DOP-PCR）があります。この方法は、確立されたDNA増幅法であるPCRを用いて、多数のプライマーセットを使用してゲノム全体を増幅しようとします。この方法は単純ですが、ゲノムカバレッジが非常に低いことが示されています。DOP-PCRの改良版として、多重置換増幅（MDA）があります。MDAは、ランダムプライマーと高忠実度酵素（通常はΦ29 DNAポリメラーゼ）を用いて、DOP-PCRよりも大きな断片を増幅し、ゲノムカバレッジを向上させます。これらの改良にもかかわらず、MDAには依然として配列依存性バイアスがあります（ゲノムの特定の部分は配列のために他の部分よりも多く増幅され、結果として得られるゲノムデータセットで一部の部分が過剰に表現されます）。DOP-PCRとMDAに見られるバイアスをほぼ回避できることが示されている方法は、多重アニーリングおよびループベース増幅サイクル（MALBAC）です。このシステムでは、コピーのコピーを作成するのではなく、元のDNA鎖のみをコピーすることでバイアスが軽減されます。MALBACを使用する主な欠点は、DNAをコピーするために使用される酵素のために、DOP-PCRやMDAと比較して精度が低下することです。^{[ 11 ]}  

上記いずれかの手法を用いて増幅されたDNAは、サンガーシーケンス法または次世代シーケンス法（NGS）を用いて配列決定することができる。

単一細胞レベルでゲノムを研究することには、主に 2 つの用途があります。 1 つの用途は、表現型の違いがしばしば見られる細菌集団で起こる変化を追跡することです。これらの違いは、集団のバルク シーケンスでは見逃されやすいですが、単一細胞シーケンスでは観察できます。^{[ 30 ]} 2 番目の主要な用途は、がんの遺伝的進化を研究することです。がん細胞は常に変異しているため、がんが個々の細胞レベルでどのように進化するかを観察することは、研究者にとって非常に興味深いことです。このような体細胞変異とコピー数異常のパターンは、単一細胞シーケンスを使用して観察できます。^{[ 2 ]}

シングルセル・トランスクリプトミクスでは、シングルセル・ゲノミクスと同様のシーケンス技術、または蛍光in situハイブリダイゼーションを用いた直接検出が用いられます。トランスクリプトームを定量化する最初のステップは、逆転写酵素を用いてRNAをcDNAに変換し、ゲノミクスで行われたようにNGS法を用いて細胞の内容物をシーケンスすることです。変換後、シーケンスするのに十分なcDNAが得られないため、シングルセル・ゲノミクスで説明したのと同じDNA増幅技術をcDNAに適用してシーケンスを可能にします。^{[ 2 ]}あるいは、RNAハイブリダイゼーションプローブに結合した蛍光化合物を用いて特定の配列を識別し、異なるRNAプローブを順次適用することで包括的なトランスクリプトームを構築します。^{[ 31 ] [ 32 ]}

シングルセル・トランスクリプトミクスの目的は、個々の細胞でどの遺伝子が発現しているかを決定することです。タンパク質レベルを十分に増幅して研究しやすい状態にすることが現状では難しいため、遺伝子発現を定量化するためにプロテオームではなくトランスクリプトームがよく使用されます。^{[ 2 ]}

この技術を用いて遺伝子発現が研究されてきた主な理由は 3 つあります。遺伝子ダイナミクス、RNA スプライシング、および細胞タイピングの研究です。遺伝子ダイナミクスは通常、遺伝子発現の変化がさまざまな細胞特性にどのような影響を与えるかを調べるために研究されます。たとえば、この種のトランスクリプトーム解析は、胚発生の研究によく用いられてきました。RNA スプライシングの研究は、さまざまな転写アイソフォームの調節を理解することに焦点を当てています。シングルセル トランスクリプトミクスは細胞タイピングにも使用されており、細胞内で発現している遺伝子を使用して、さまざまな種類の細胞を識別および分類します。細胞タイピングの主な目標は、既知の遺伝子マーカーを発現しない細胞のアイデンティティを決定する方法を見つけることです。^{[ 2 ]}

RNA発現はタンパク質量の指標として利用できる。しかし、タンパク質量はRNA発現と転写後プロセスの複雑な相互作用によって制御される。技術的にはより困難ではあるが、翻訳は単一細胞におけるリボソームプロファイリングによってモニタリングできる。 ^{[ 33 ]}

シングルセルプロテオミクスには、抗体ベースの方法、蛍光タンパク質ベースの方法、質量分析法ベースの方法の 3 つの主要なアプローチがあります。^{[ 34 ] [ 18 ]}

プロテオームを研究する目的は、単一細胞レベルでのタンパク質の活性をよりよく理解することです。タンパク質は細胞の動作方法を決定する役割を担っているため、単一細胞のプロテオームを理解することで、細胞がどのように機能し、さまざまな環境刺激によって細胞内の遺伝子発現がどのように変化するかを最もよく理解することができます。トランスクリプトミクスはプロテオミクスと同じ目的を持っていますが、転写後調節を考慮していないため（すべてのメッセンジャーRNA転写産物が実際にタンパク質に翻訳されるわけではない）、細胞内の遺伝子発現を決定する精度はそれほど高くありません。^{[ 12 ]}もちろん、RNAレベルとタンパク質レベルの違いを研究することで、どの遺伝子が転写後調節されているかについての洞察が得られるため、トランスクリプトミクスは依然として重要です。

単一細胞のメタボロームを定量化するために使用される主な方法は 4 つあります。蛍光ベースの検出、蛍光バイオセンサー、FRETバイオセンサー、および質量分析です。最初に挙げた 3 つの方法は、蛍光顕微鏡を使用して細胞内の分子を検出します。通常、これらのアッセイでは、目的の分子に小さな蛍光タグを取り付けますが、これは単一細胞メタボロミクスには侵襲性が高すぎることが示されており、代謝物の活性を変化させます。この問題に対する現在の解決策は、代謝物検出器として機能し、目的の代謝物に結合すると蛍光を発する蛍光タンパク質を使用することです。^{[ 67 ]}

質量分析法は、単一細胞メタボロミクスで最も頻繁に使用される方法になりつつあります。その利点は、関心のあるすべての分子に対して蛍光タンパク質を開発する必要がなく、フェムトモル範囲の代謝物を検出できることです。^{[ 15 ]}プロテオミクスで議論された方法と同様に、質量分析法とキャピラリー電気泳動などの分離技術を組み合わせて代謝物を定量することにも成功しています。この方法も、フェムトモル濃度で存在する代謝物を検出できます。^{[ 67 ]}キャピラリーマイクロサンプリングとイオン移動度分離を伴う質量分析法を組み合わせた別の方法は、単一細胞メタボロミクスの分子カバレッジとイオン分離を向上させることが実証されています。^{[ 21 ] [ 68 ]} さらに、いわゆるライブ単一細胞質量分析法と呼ばれる直接注入質量分析法も、ヒト細胞で成功裏に実施されています。^{[ 69 ]}研究者たちは、現在の技術に欠けているものを満たす技術、すなわち、ハイスループット、存在量が少ない、またはイオン化効率が低い代謝物に対する高感度、良好な再現性、および代謝物の定量化を可能にする技術の開発に取り組んでいる。^{[ 70 ]}

シングルセルメタボロミクスの目的は、がん、幹細胞、老化、薬剤耐性の発達などの主要な生物学的トピックを分子レベルでより深く理解することです。一般的に、メタボロミクスの焦点は、細胞が分子レベルで環境ストレスにどのように対処するかを理解することと、細胞機能のより動的な理解を与えることにあります。^{[ 67 ]}