CITE-Seq

CITE-Seq ( Cellular Indexing of T ranscriptomes and E pitopes by Seq uencing) は、単一細胞レベルで利用可能な抗体を使用して表面タンパク質に関する定量的および定性的な情報を取得するとともにRNA シーケンスを実行する方法です。 ^[1]これまでのところ、この方法は細胞あたり数個のタンパク質でのみ機能することが実証されています。そのため、プロテオミクスとトランスクリプトミクスの両方のデータを組み合わせることで、同じ細胞の追加レイヤーの情報を提供します。表現型解析の場合、この方法はフローサイトメトリー(ゴールドスタンダード)と同等の精度であることが、これを開発したグループによって実証されています。 ^[2]現在、REAP-Seq とともに、異なる種で遺伝子発現とタンパク質レベルの両方を同時に評価する主要な方法の 1 つです。

この方法は、ニューヨークゲノムセンターとサティヤ研究室の協力により確立されました。 ^[2]一方、同様のアプローチは以前にアブビトロ社によって示されていました。

タンパク質と転写産物の両方のレベルを同時に測定することで、開発者が触れたいくつかの生物学分野で CITE-Seq を使用する機会が生まれます。たとえば、主要な研究分野であるさまざまな癌における腫瘍の異質性を特徴付けるために使用できます。^[3]また、高スループットの単一細胞法として細胞のまれなサブポピュレーションを識別できるため、バルク法では失われる情報を検出できます。^[3]また、腫瘍の分類、たとえば新しいサブタイプの識別にも役立つ可能性があります。^[3]上記のすべては、タンパク質と転写産物の両方のデータが同時に単一細胞から出力されるため可能になり、タンパク質と RNA の相関関係に関する新しい情報にもつながります。

また、免疫学においても可能性を秘めています。例えば、免疫細胞の特性評価に活用できます。最近のT細胞に関する研究では、T細胞がエフェクター状態を維持する能力が調査されています。^[4] CITE-Seqの共著者の1人による別の研究では、CITE-Seqが宿主と病原体の相互作用のメカニズムを調べる方法として提案されています。^[5]

CITE-seq は、他のシーケンシング技術と同様に、実際の抗体を準備し、細胞を染色し、cDNAを合成し、さらにシーケンシングする RNA ライブラリを準備するウェット ラボ部分と、得られたシーケンシング データを分析するドライ ラボ部分があります。ウェット ラボ実験で最も重要な部分は、抗体オリゴヌクレオチド コンジュゲートを設計し、目的の読み取りと定量化を達成するためにプール内に存在する必要のある各コンジュゲートの量を滴定することです。

最初のステップは、抗体オリゴ複合体（抗体由来タグ（ADT）とも呼ばれる）を準備することです。ADTの準備には、抗体をバーコード化するためのオリゴヌクレオチドを使用して、対象の細胞表面タンパク質に対する抗体を標識することが含まれます。

ADTができたら、次のステップは細胞を目的のADTプールに結合することです。scRNA-seqライブラリは、Drop-seq、10X Genomics、またはddSeq法を使用して準備できます。簡単に言うと、ADTで標識された細胞は、DNAバーコード付きマイクロビーズを含む単一細胞として液滴内にカプセル化されます。^[6]

次に、液滴内で細胞が溶解され、結合した ADT と mRNA の両方が放出されます。これらは次に cDNA に変換されます。マイクロビーズ上の各 DNA 配列には固有のバーコードがあり、cDNA は細胞バーコードでインデックス化されます。cDNA は ADT と細胞 mRNA の両方から作成されます。

次のステップでは、開発者のガイドラインに基づいて、cDNAをPCR増幅し、ADT cDNAとmRNA cDNAをサイズに基づいて分離します（通常、ADT由来のcDNAは180bp未満、mRNA由来のcDNAは300bp以上です）。^[7]分離された各cDNA分子は独立して増幅および精製され、シーケンスライブラリが準備されます。最後に、独立したライブラリをプールしてシーケンスします。このようにして、1回のシーケンス実行からプロテオミクスとトランスクリプトミクスのデータを取得できます。

単一細胞シーケンスの解析には、データを正規化する最良の方法を決定するなど、多くの課題があります。^[8]単一細胞レベルでのタンパク質と転写産物の両方のシーケンスから生じる新たなレベルの複雑さのため、CITE-Seqの開発者とその協力者は、データ分析を支援するいくつかのツールを維持しています。

開発者ガイドラインに基づくscRNA-Seqデータ分析: ^{[2] [9]}初期分析手順は、標準的なscRNA-Seq実験と同じです。まず、読み取りを対象種の参照ゲノムにアラインメントし、参照にマッピングされた転写産物の数が非常に少ない細胞を除去します。最後に、遺伝子発現値を含む正規化されたカウントマトリックスが得られます。

ADT データ分析^{[2] [7] [10] [11]} (開発者のガイドラインに基づく) : CITE-seq-Count は CITE-Seq 開発者の Python パッケージで、生のカウントを取得するために使用できます。Satija 研究室の Seurat パッケージでは、さらにタンパク質と RNA のカウントを組み合わせて両方の測定値に対してクラスタリングを実行できるほか、対象の細胞クラスター間で差次的発現解析を行うこともできます。ADT 定量化では、抗体間の違いを考慮する必要があります。さらに、scRNA-Seq分析と同様に、ノイズを減らすためにフィルタリングが必要になる場合があります。ただし、RNA データとは対照的に、細胞内のタンパク質の量が多いため、ドロップアウトは少なくなります。

解析の結果、PCA や tSNE などの方法による新しい細胞クラスター、特定の細胞機能に関与する重要な遺伝子、および関心のある問題に特有のその他の新しい知識が特定される可能性があります。一般に、ADT カウントで得られる結果は、単一細胞トランスクリプトミクスで得られる情報量を大幅に増加させます。

抗体-オリゴヌクレオチド複合体の用途は CITE-seq を超えて拡大しており、サンプルの多重化やCRISPRスクリーンにも適応できます。

セルハッシュ： ニューヨークゲノムセンターは、抗体オリゴヌクレオチド複合体の使用をさらに改良し、scRNA-seqのサンプルマルチプレックス化を可能にしました。セルハッシュ^[12]と呼ばれるこの技術は、特定の組織サンプルから普遍的に発現している細胞表面タンパク質に対してオリゴヌクレオチド標識抗体を使用します。この場合、オリゴヌクレオチド配列には、異なるサンプルの細胞に固有の一意のバーコードが含まれます。このサンプル固有の細胞タグ付けにより、シーケンシングプラットフォームで異なるサンプルから作成されたシーケンシングライブラリをプールできます。抗体タグを細胞トランスクリプトームとともにシーケンシングすると、分析された各細胞の起源サンプルを識別するのに役立ちます。セルハッシュ抗体で使用される一意のバーコード配列は、CITE-seqで使用されるADTに存在する抗体バーコードとは異なるように設計できます。これにより、1回のシーケンシング実行でセルハッシュとCITE-seqを組み合わせることができます。^[12]セルハッシュ法はscRNA-seqプラットフォームのスーパーローディングを可能にし、シーケンシングのコストを削減します。また、scRNA-seqの大きな課題である多重化からのアーティファクト信号の検出も可能になります。セルハッシュ法は、Gaublommeらによって核ハッシュ法を実行することで単一核RNA-seq（ snRNA-seq ）を多重化するためにさらに使用されています。^[13]

ECCITE- seq :シーケンシングによるトランスクリプトームおよびEピトープの拡張C RISPR互換細胞インデックス作成（ECCITE - seq ）は、CITE-seqを使用して単一細胞から複数のモダリティを特徴付けるために開発されました。基本的なCITE-seqプロトコルを5'タグベースのscRNA-seqアッセイに変更することで、各単一細胞からトランスクリプトーム、免疫受容体クロノタイプ、表面マーカー、サンプルID、およびシングルガイドRNA（sgRNA）を検出できます。^[14] sgRNA分子を検出し、遺伝子発現レベルへの影響を測定するECCITE-seqの能力は、この技術をCRISPRスクリーンに適用する可能性を開きます。

利点: CITE-seq では、単一細胞のトランスクリプトームとプロテオームの同時分析が可能です。単一細胞ソートからのインデックスソート測定を scRNA-seq と組み合わせるこれまでの取り組みは、小さなサンプルサイズの実行に限られており、マルチプレックス化や大規模な並列ハイスループットシーケンシングには対応していませんでした。CITE-seq は、10X Genomics やDrop-seqなどのハイスループットマイクロ流体プラットフォームと互換性があることが示されています。また、マイクロ/ナノウェルプラットフォームにも適応できます。セルハッシュと組み合わせることで、バルクサンプルへの CITE-seq の適用やサンプルのマルチプレックス化が可能になります。これらの技術は、複数のサンプルでのハイスループットシーケンシングの全体的なコストを削減するのに役立ちます。最後に、CITE-seq は、小分子、RNA 干渉、CRISPR、その他の遺伝子編集技術の検出に適応できます。

制限事項: CITE-Seq の制限事項の 1 つは、位置情報が失われることです。細胞の処理方法により、サンプル内の細胞の空間分布や細胞内のタンパク質は不明です。^{[15] [9]}さらに、この方法は、ノイズ量が多いことや、低発現遺伝子の検出が困難になる可能性があることなど、scRNA-Seq の課題を共有しています。^[9]表現型解析の点では、現在利用可能なパネルに対象のタンパク質が含まれていない場合、アッセイと抗体の最適化にも潜在的な問題が生じます。 ^[16]さらに、現時点では CITE-Seq では細胞内タンパク質を検出できません。^[16]現在のプロトコルでは、透過化ステップで多くの課題が発生するため、この手法は表面マーカーに限定されます。

• REAP-seq:メルク社のピーターソンらは、CITE-seqに似たRNA発現およびタンパク質配列アッセイ（REAP-seq）と呼ばれる技術を開発しました。REAP-seqはCITE-seqと同様に、単一細胞内の転写産物とタンパク質の両方のレベルを測定しますが、2つの技術の違いは抗体をオリゴヌクレオチドに結合する方法です。CITE-seqは通常、抗体へのストレプトアビジン結合とオリゴヌクレオチドへのビオチン結合を介して、オリゴヌクレオチドを抗体に非共有結合で結合します。REAP-seqは、抗体とアミノ化DNAバーコードを共有結合で結合します^[17]
• PLAYR: PLAYRまたはRNAの近位ライゲーションアッセイは、質量分析法を利用して単一細胞内のトランスクリプトームとタンパク質レベルを同時に分析します。この技術では、タンパク質とRNA転写産物の両方が、それぞれ同位体結合抗体と同位体標識プローブで標識され、質量分析計で検出できるようになります^[18]