一時的な表現

一過性発現は、より一般的には「一過性遺伝子発現」と呼ばれ、核酸（最も一般的には発現カセットをコードするプラスミド DNA）が、リン酸カルシウム（CaPi）やポリエチレンイミン（PEI）などの化学送達剤を使用して真核細胞に導入された後、短時間発現される遺伝子の一時的な発現である。 ^[1]しかし、「安定発現」とは異なり、外来 DNA は宿主細胞 DNA と融合しないため、数回の細胞複製サイクル後にベクターが必然的に失われる。^[2]一過性遺伝子発現の大部分は、培養された動物細胞で行われる。この技術は植物細胞でも使用されているが、これらの細胞への核酸の導入には、動物細胞の場合とは異なる方法が必要である。植物と動物の両方において、一過性発現は、導入された核酸の使用期間を限定する結果となるはずであり、長期の発現は「安定発現」と呼ばれることになる。

方法論は、形質転換する生物によって異なります。植物は、アグロインフィルトレーションまたはフローラルディップを介してアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入されたコンストラクトで形質転換できますが、ほとんどの動物細胞にはウイルスベクターが必要です。ヒトでは、一過性形質転換の分野は、2020～2021年のCOVID-19パンデミック中に急速に進歩し、主要なCOVID-19ワクチンは、ヒトまたはアデノウイルスベクターへのmRNAの直接導入を使用し、RNAを宿主ヒトで発現させて免疫反応を誘発するスパイクタンパク質を生成しました。

利点

細胞内で一過性発現または安定発現のどちらを誘導するかを選択する場合、時間枠と実験目標を考慮する必要があります。一過性にトランスフェクトされた細胞は、短期的な遺伝子発現の効果の研究、RNA干渉（RNAi）を介した遺伝子サイレンシングの実行、または小規模な組み換えタンパク質の迅速な生成によく使用されます。^[3]この少量の組み換えタンパク質の迅速な生成は、薬剤候補としての可能性を評価したり、ベクター開発段階で構造の完全性を調べたりするために適用できます。さらに、一過性発現は、安定的にトランスフェクトされた細胞で時間のかかるスケールアッププロセスを実行する前に、選択したパラメータを最適化することを目指す場合に便利なツールになります。^[4]通常、細胞はトランスフェクションが成功した後1〜4日以内に収穫されます。さらに迅速な結果を得るには、DNAをmRNAに置き換えると、一部のシステムではトランスフェクションが成功した後数分以内に一過性発現が得られます。このプロセスは、核への移行と転写をバイパスします。^[5]

安定した長期的遺伝子発現が望まれる場合、細胞の安定したトランスフェクションがより有用です。ただし、DNA ベクターの染色体への組み込みが成功することはまれであるため、このプロセスはより困難で時間がかかり、大規模なタンパク質生産、遺伝子治療、および長期的薬理学研究にのみ使用されます。

植物細胞における発現

アグロバクテリウムによる遺伝子組み換え

(a) アグロバクテリア腫瘍誘発プラスミドの無力化と植物ウイルス調節配列との融合のプロセスを示しています。 (b) 別々のバイナリベクターを含む複数のアグロバクテリア培養物、または複数の発現カセットを含む単一のベクターを持つ培養物の浸潤による共発現を示しています。

一過性発現のための遺伝子組み換え植物の生産に使用される主な技術は、アグロバクテリウム媒介遺伝子形質転換、または「アグロインフィルトレーション」とウイルス発現装置である。^[6] アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよび関連するアグロバクテリウム種は、バイナリベクターシステムを使用して、特定のDNA断片（トランスファーDNAまたはT-DNAと呼ばれる）を植物の核に効率的に転送するように設計された、よく知られた植物病原体である。バイナリベクターシステムは、 T-DNAバイナリベクターとvirヘルパープラスミドで構成される。 ^[7]このバイナリベクターは、転送を仲介するのに役立つトランスアクティング毒性タンパク質からT-DNAを分離する。 ^{[8]この方法の利点には、標準的な分子生物学技術による、小型で広範囲の宿主範囲のプラスミドのモジュール性がある。さらに、}アグロバクテリウム株の親腫瘍誘発プラスミドは無害化されており、生殖細胞の変更ではなく非生殖細胞のみが変更されているため、このプロセスは環境に無害であると考えられている。^[6]

このプロセスの応用により、合成生物学における植物の利用が進歩しました。植物由来のバイオ製品は、従来の哺乳類細胞発現システムに対して高い競争力を持つことが期待されています。

哺乳類細胞における発現

哺乳類細胞発現システムは、組換えタンパク質とその相補的な翻訳後修飾の一時的な生産に不可欠です。実際、現在市販されている治療用タンパク質の約半分は哺乳類細胞で生産されています。しかし、哺乳類細胞システムの成長が遅いこと、成長に正確な要件があること、動物ウイルスによる感染の潜在的なリスクなど、多くの課題があります。その結果、一時的な組換えタンパク質生産のホストとして機能する哺乳類細胞株がますます多く確立されています。^[2]

HEK293細胞

アフリカミドリザル腎臓（COS）やハムスターの赤ちゃん腎臓（BHK）などの他の細胞株も組み換えタンパク質の生産に使用できますが、哺乳類細胞の一過性発現に最も一般的に使用される宿主システムは、1977年にGrahamらによって確立されたヒト胎児腎臓細胞株に基づくHEK293細胞株の誘導体です。 ^[9] HEK293細胞株は、せん断されたアデノウイルス5 DNAによる形質転換によって作成されました。^[10]この細胞株を使用する利点は、トランスフェクション率が高く、血清を含まない培地で増殖できるため、コストが削減され、血清に通常含まれる動物由来物質による汚染のリスクが低くなることです。^[2]

その後、SV40ウイルスやエプスタイン・バーウイルス（EBV）などの哺乳類ウイルス由来のウイルス要素を組み込むことで、いくつかの改変されたサブラインが開発されました。これらのウイルス要素は、エピソーム状態でプラスミドDNAを高度に保持し、特定のウイルス特性を介して転写および翻訳を増加させる能力で注目されています。^{[11]これらの後期のサブラインは、結果として、SV20複製起点（SV40}ori ）に結合するSV40ラージT抗原と、関連する複製起点（ oriP）に結合するEBV由来核抗原-1（EBNA-1 ）タンパク質という2つの相互作用するコンポーネントを持つことが特定されました。^[11]

PEI-25kDaを用いてトランスフェクトされたHEK293細胞における一過性発現の典型的な歴史的収量は、組換え抗体タンパク質20～40 mg/Lであった。2008年に、Backliwalらは、組換え抗体タンパク質1 g/Lを超える収量を初めて報告した。^[12]

CHO細胞

伝統的に、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、生物製剤用の安定した細胞株の確立に関連付けられています。しかし、最近では、一過性のタンパク質生産のためにCHO細胞を設計する試みが注目を集めています。CHO細胞は、in vitro培養用に確立された最も初期の細胞株の1つであり、生物学的製品の生産および製造のためのホストとしての潜在性は依然として人気があります。^[11] CHO細胞は、工業的なスケールアップが容易であること、多様な生体分子の生産に汎用性があること、ヒトウイルスの感染リスクが低いことなどの利点があるため、一過性の発現に適しています。^[13] 3つの主要な発現システムが確立されています。

EBNA-1改変CHO細胞株
CHO EBNA LT細胞株はEBNA-1遺伝子とマウスポリオーマウイルスラージT抗原を別に保有している^[14]
Epi CHOシステムは、ポリオーマウイルスラージT抗原遺伝子を導入したCHO細胞株と、自律複製のためのポリオーマウイルス起源（PyOri）とプラスミド保持のためのEBV EBNA-1およびOriPをコードするDNA発現ベクターで構成されています。^[15]^[16]

参考文献

^ Hacker DL (2011-01-01)。「2.29 - 組換え技術」。Moo-Young M、Wurm FM (編)。包括的バイオテクノロジー(第 2 版)。バーリントン: アカデミックプレス。pp. 401–406。doi : 10.1016 / b978-0-08-088504-9.00120-3。ISBN 978-0-08-088504-9。
^ abc Glick BR、Patten CL（2017年1月）。分子バイオテクノロジー：組換えDNAの原理と応用（第5版）。doi ： 10.1128/9781555819378。ISBN 9781555819378。
^ Strohl WR、Strohl LM (2013)。治療用抗体エンジニアリング：製薬業界で最も強力な成長分野を推進する現在および将来の進歩。ケンブリッジ、英国：Woodhead Publishing。ISBN 978-1-907568-37-4. OCLC 870891982.
^ Menassa R、Ahmad A、Joensuu JJ (2011-09-21)。「アグロインフィルトレーションを用いた一過性発現と分子農業への応用」。植物の分子農業：最近の進歩と将来の展望。ドルドレヒト：Springer Netherlands。pp. 183–198。doi : 10.1007 /978-94-007-2217-0_9。ISBN 978-94-007-2216-3。
^ Strohl WR、Strohl LM (2012)。「治療用抗体クラス」。治療用抗体エンジニアリング：製薬業界で最も成長している分野を推進する現在および将来の進歩（第 1 版）。ソーストン：ウッドヘッド出版。pp. 197–223。doi : 10.1533 /9781908818096.197。ISBN 9781907568374。
^ ab Sainsbury F, Lomonossoff GP (2014 年 6 月). 「植物における合成生物学の一過性発現」. Current Opinion in Plant Biology . SI: 生理学と代謝. 19 (100): 1–7. Bibcode :2014COPB...18D...5B. doi :10.1016/j.pbi.2014.02.003. PMC 4070481. PMID 24631883 .
^ Bevan M (1984 年 11 月). 「植物形質転換のためのバイナリーアグロバクテリウムベクター」. Nucleic Acids Research . 12 (22): 8711–8721. doi :10.1093/nar/12.22.8711. PMC 320409. PMID 6095209 .
^ 「『無傷の葉のためのアグロバクテリウム媒介一過性遺伝子発現システム』に対する訂正 [Plant Sci. 122 (1997) 101–108]」。Plant Science . 124 (2): 227. 1997年5月。Bibcode : 1997PlnSc.124..227 .. doi : 10.1016/s0168-9452(97)04651-7。ISSN 0168-9452。
^ Voynov V, Caravella JA (2012). 治療用タンパク質：方法とプロトコル（第2版）。ニューヨーク：Humana Press。ISBN 978-1-61779-921-1. OCLC 798095845.
^ Graham FL、Smiley J、Russell WC、Nairn R (1977 年 7 月)。「ヒトアデノウイルス 5型の DNA によって形質転換されたヒト細胞株の特性」。The Journal of General Virology。36 ( 1): 59–74。doi : 10.1099 /0022-1317-36-1-59。PMID 886304。
^ abc Geisse S、Voedisch B (2012)。「一過性発現技術：過去、現在、そして未来」。治療用タンパク質。分子生物学の方法。第899巻。ニュージャージー州トトワ：ヒューマナ・プレス。pp. 203–219。doi : 10.1007 / 978-1-61779-921-1_13。ISBN 978-1-61779-920-4. PMID 22735955。
^ Backliwal G、Hildinger M、Chenuet S、Wulhfard S、De Jesus M、Wurm FM (2008 年 9 月)。「HEK 293E 細胞の合理的なベクター設計とマルチパスウェイ変調により、無血清条件下での一過性トランスフェクションで 1 g/L を超える組換え抗体力価が実現」。Nucleic Acids Research。36 ( 15 ) : e96。doi : 10.1093/nar/gkn423。PMC 2528171。PMID 18617574。 {{cite journal}}: CS1 maint: 複数の名前: 著者リスト (リンク)
^ Daramola O、Stevenson J、Dean G、Hatton D、Pettman G、Holmes W、Field R (2014)。「高収量CHO一過性システム：EBNA-1およびGSをコードする遺伝子の共発現により一過性タンパク質発現が促進される」。バイオテクノロジー進歩。30（1）：132–141。doi ：10.1002/btpr.1809。PMID 24106171。S2CID 20068880。
^ Silla T、Hääl I、Geimanen J、Janikson K、Abroi A、Ustav E、Ustav M (2005 年 12 月)。「マウス細胞におけるハイブリッド起源プラスミドのエピソーム維持」。Journal of Virology。79 ( 24 ) : 15277–15288。doi : 10.1128 /jvi.79.24.15277-15288.2005。PMC 1316011。PMID 16306599。
^ Codamo J、Munro TP、Hughes BS、Song M 、 Gray PP (2011 年 6 月)。「epi-CHO 発現システムによる CHO 細胞ベースの一過性遺伝子発現の強化」。分子バイオテクノロジー。48 (2): 109–115。doi : 10.1007 /s12033-010-9351-9。PMID 21104043。S2CID 42312966 。
^ Kunaparaju R 、Liao M、 Sunstrom NA (2005 年 9 月)。「Epi-CHO、CHO 細胞での組み換えタンパク質生産のためのエピソーム発現システム」。バイオテクノロジーとバイオエンジニアリング。91 (6): 670–677。doi : 10.1002/bit.20534。hdl : 1959.4 /41499。PMID 15948170。

外部リンク

Canto T (2016)。「植物における一過性発現システム：可能性と制約」。タンパク質複合体の生産と特性評価のための先進技術。実験医学と生物学の進歩。第896巻。pp. 287–301。doi : 10.1007 /978-3-319-27216-0_18。hdl : 10261 /135535。ISBN 978-3-319-27214-6. PMID 27165332。
Grimsley N、Hohn B、Hohn T、Walden R (1986 年 5 月)。「Ti プラスミドを使用した植物のウイルス感染の代替ルートである「アグロインフェクション」」。米国科学アカデミー紀要。83 (10): 3282–3286。Bibcode : 1986PNAS ...83.3282G。doi : 10.1073 / pnas.83.10.3282。PMC 323497。PMID 16593697。
Patrick M.「プラスミド 101: 酵母ベクター」。blog.addgene.org。
「一過性発現と安定発現」www.genscript.com。

[1] Hacker DL (2011-01-01)。「2.29 - 組換え技術」。Moo-Young M、Wurm FM (編)。包括的バイオテクノロジー(第 2 版)。バーリントン: アカデミックプレス。pp. 401–406。doi : 10.1016 / b978-0-08-088504-9.00120-3。ISBN 978-0-08-088504-9。

[Glick_2017-2] Glick BR、Patten CL（2017年1月）。分子バイオテクノロジー：組換えDNAの原理と応用（第5版）。doi ： 10.1128/9781555819378。ISBN 9781555819378。

[3] Strohl WR、Strohl LM (2013)。治療用抗体エンジニアリング：製薬業界で最も強力な成長分野を推進する現在および将来の進歩。ケンブリッジ、英国：Woodhead Publishing。ISBN 978-1-907568-37-4. OCLC 870891982.

[4] Menassa R、Ahmad A、Joensuu JJ (2011-09-21)。「アグロインフィルトレーションを用いた一過性発現と分子農業への応用」。植物の分子農業：最近の進歩と将来の展望。ドルドレヒト：Springer Netherlands。pp. 183–198。doi : 10.1007 /978-94-007-2217-0_9。ISBN 978-94-007-2216-3。

[5] Strohl WR、Strohl LM (2012)。「治療用抗体クラス」。治療用抗体エンジニアリング：製薬業界で最も成長している分野を推進する現在および将来の進歩（第 1 版）。ソーストン：ウッドヘッド出版。pp. 197–223。doi : 10.1533 /9781908818096.197。ISBN 9781907568374。

[:3-6] Sainsbury F, Lomonossoff GP (2014 年 6 月). 「植物における合成生物学の一過性発現」. Current Opinion in Plant Biology . SI: 生理学と代謝. 19 (100): 1–7. Bibcode :2014COPB...18D...5B. doi :10.1016/j.pbi.2014.02.003. PMC 4070481. PMID 24631883 .

[7] Bevan M (1984 年 11 月). 「植物形質転換のためのバイナリーアグロバクテリウムベクター」. Nucleic Acids Research . 12 (22): 8711–8721. doi :10.1093/nar/12.22.8711. PMC 320409. PMID 6095209 .

[8] 「『無傷の葉のためのアグロバクテリウム媒介一過性遺伝子発現システム』に対する訂正 [Plant Sci. 122 (1997) 101–108]」。Plant Science . 124 (2): 227. 1997年5月。Bibcode : 1997PlnSc.124..227 .. doi : 10.1016/s0168-9452(97)04651-7。ISSN 0168-9452。

[:0-9] Voynov V, Caravella JA (2012). 治療用タンパク質：方法とプロトコル（第2版）。ニューヨーク：Humana Press。ISBN 978-1-61779-921-1. OCLC 798095845.

[10] ^ Graham FL、Smiley J、Russell WC、Nairn R (1977 年 7 月)。「ヒトアデノウイルス 5型の DNA によって形質転換されたヒト細胞株の特性」。The Journal of General Virology。36 ( 1): 59–74。doi : 10.1099 /0022-1317-36-1-59。PMID 886304。

[Geisse_2012-11] Geisse S、Voedisch B (2012)。「一過性発現技術：過去、現在、そして未来」。治療用タンパク質。分子生物学の方法。第899巻。ニュージャージー州トトワ：ヒューマナ・プレス。pp. 203–219。doi : 10.1007 / 978-1-61779-921-1_13。ISBN 978-1-61779-920-4. PMID 22735955。

[12] Backliwal G、Hildinger M、Chenuet S、Wulhfard S、De Jesus M、Wurm FM (2008 年 9 月)。「HEK 293E 細胞の合理的なベクター設計とマルチパスウェイ変調により、無血清条件下での一過性トランスフェクションで 1 g/L を超える組換え抗体力価が実現」。Nucleic Acids Research。36 ( 15 ) : e96。doi : 10.1093/nar/gkn423。PMC 2528171。PMID 18617574。 {{cite journal}}: CS1 maint: 複数の名前: 著者リスト (リンク)

[13] Daramola O、Stevenson J、Dean G、Hatton D、Pettman G、Holmes W、Field R (2014)。「高収量CHO一過性システム：EBNA-1およびGSをコードする遺伝子の共発現により一過性タンパク質発現が促進される」。バイオテクノロジー進歩。30（1）：132–141。doi ：10.1002/btpr.1809。PMID 24106171。S2CID 20068880。

[14] Silla T、Hääl I、Geimanen J、Janikson K、Abroi A、Ustav E、Ustav M (2005 年 12 月)。「マウス細胞におけるハイブリッド起源プラスミドのエピソーム維持」。Journal of Virology。79 ( 24 ) : 15277–15288。doi : 10.1128 /jvi.79.24.15277-15288.2005。PMC 1316011。PMID 16306599。

[15] ^ Codamo J、Munro TP、Hughes BS、Song M 、 Gray PP (2011 年 6 月)。「epi-CHO 発現システムによる CHO 細胞ベースの一過性遺伝子発現の強化」。分子バイオテクノロジー。48 (2): 109–115。doi : 10.1007 /s12033-010-9351-9。PMID 21104043。S2CID 42312966 。

[16] ^ Kunaparaju R 、Liao M、 Sunstrom NA (2005 年 9 月)。「Epi-CHO、CHO 細胞での組み換えタンパク質生産のためのエピソーム発現システム」。バイオテクノロジーとバイオエンジニアリング。91 (6): 670–677。doi : 10.1002/bit.20534。hdl : 1959.4 /41499。PMID 15948170。