エピゲノミクス

エピゲノミクスは、細胞の遺伝物質に対するエピジェネティックな修飾の完全なセット（エピゲノム）を研究する分野です。この分野は、細胞のゲノムとプロテオームを研究するゲノミクスやプロテオミクスに類似しています。 ^{[1] [2]}エピジェネティックな修飾は、細胞のDNAまたはヒストンに対する可逆的な修飾であり、DNA配列を変更せずに遺伝子発現に影響します。^[3]エピゲノムの維持は継続的なプロセスであり、DNA修復などの重要な生物学的メカニズムに関与することにより、真核生物のゲノムの安定性に重要な役割を果たしています。^{[4] [5]}植物フラボンは、がんを引き起こすエピゲノムマークを阻害すると言われています。^[6]最も特徴付けられたエピジェネティックな修飾の2つは、DNAメチル化とヒストン修飾です。 エピジェネティックな修飾は、遺伝子発現と制御に重要な役割を果たし、分化/発達^[7]や腫瘍形成などの多くの細胞プロセスに関与しています。^[8]エピジェネティクスの地球規模での研究は、ゲノムハイスループットアッセイの導入によって最近になってようやく可能になった。^{[9] [7]}

一次DNA配列の改変に起因しない遺伝子発現を変化させ、有糸分裂および減数分裂によって遺伝するゲノム改変は、エピジェネティック改変として分類される。DNAメチル化とヒストン修飾は、最もよく特徴付けられたエピジェネティックプロセスの1つである。^[3]

最初に詳細に特徴付けられたエピジェネティック修飾は DNA メチル化でした。その名前が示すように、DNA メチル化はDNA にメチル基が追加されるプロセスです。この反応を触媒する酵素はDNA メチルトランスフェラーゼ (DNMT)です。DNA メチル化は安定しており遺伝性がありますが、DNA 脱メチル化酵素として知られる拮抗的な酵素群によって元に戻すことができます。真核生物では、メチル化はグアニンに隣接するシトシン残基の炭素 5 位 (5mC) に最もよく見られ、CpG ジヌクレオチドと呼ばれます。^{[9] [10]}

DNAメチル化のパターンは種によって大きく異なり、同じ生物内でも大きく異なります。動物間でのメチル化の使用法は大きく異なり、脊椎動物は5mCのレベルが最も高く、無脊椎動物は5mCのレベルが中程度です。Caenorhabditis elegansのような一部の生物は5mCも従来のDNAメチルトランスフェラーゼも持っていないことが実証されています。これはDNAメチル化以外のメカニズムも関与していることを示唆しています。^[11]

生物体内では、DNAメチル化レベルは発達の過程や部位によっても変化する。例えば、マウスの始原生殖細胞では、ゲノム全体の脱メチル化が起こり、着床段階までにメチル化レベルは以前の体細胞値に戻る。^{[11]転写開始部位である}プロモーター領域 でDNAメチル化が起こると、遺伝子発現を抑制する効果がある。これは、活発に発現している遺伝子に関連するメチル化されていないプロモーター領域とは対照的である。^[9]

DNAメチル化が遺伝子発現を抑制するメカニズムは、多段階のプロセスです。メチル化されたシトシン残基とメチル化されていないシトシン残基の区別は、特定のDNA結合タンパク質によって行われます。これらのタンパク質の結合により、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）がリクルートされ、クロマチンリモデリングが開始され、DNAがRNAポリメラーゼなどの転写機構にアクセスしにくくなり、遺伝子発現が効果的に抑制されます。^[12]

真核生物では、ゲノム DNA はクロマチンと呼ばれるタンパク質-DNA 複合体に巻き付いています。 クロマチンで最も多く見られるタンパク質であるヒストンは、DNA を凝縮する働きをします。ヒストンの正味の電荷は、負に帯電している DNA との結合を促進します。クロマチンの基本単位および繰り返し単位であるヌクレオソームは、ヒストンタンパク質(H2A、H2B、H3、H4) のオクタマーと、それを囲む 146 bp の長さの DNA で構成されています。ヌクレオソームと DNA の接続により、直径 10 nm のクロマチン繊維が形成され、さらに凝縮することができます。^{[13] [14]}

DNAのクロマチンパッケージングは​​、細胞周期の段階と局所DNA領域によって異なります。^[15]クロマチンの凝縮度は、特定の転写状態と関連しています。パッケージ化されていない、または緩いクロマチンは、転写機構にアクセスしやすいため、しっかりとパッケージ化されたクロマチンよりも転写活性が高くなります。クロマチン構造を再構築し、DNAパッケージングの密度を変更することで、遺伝子発現を調節することができます。^[14]

クロマチンリモデリングは、コアヒストンタンパク質のN末端テールの翻訳後修飾を介して起こる。^[16]特定の細胞におけるヒストン修飾の集合体は、ヒストンコードとして知られている。アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化、ADPリボシル化、脱アミノ化、プロリン異性化など、多くの異なるタイプのヒストン修飾が知られている。アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化は遺伝子活性化に関係しているのに対し、メチル化、ユビキチン化、SUMO化、脱アミノ化、プロリン異性化は遺伝子抑制に関係している。メチル化、リン酸化、ユビキチン化を含むいくつかの修飾タイプは、修飾されるヒストン上の特定のアミノ酸に応じて、異なる転写状態に関連付けることができることに留意されたい。さらに、ヒストン修飾が起こるDNA領域も異なる効果を引き起こす可能性がある。一例として、第3コアヒストンのリジン残基36のメチル化（H3K36）が挙げられます。H3K36が遺伝子のコード領域に発生すると遺伝子活性化と関連しますが、プロモーター領域内にある場合は逆のことが起こります。^[14]

ヒストン修飾は、ヌクレオソーム間の接触の破壊とクロマチンリモデリングATPaseのリクルートという2つのメカニズムによって遺伝子発現を制御します。最初のメカニズムの例は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）によって触媒されるリジン末端アミノ酸のアセチル化中に発生します。HATは、活性化因子がDNA結合部位に結合するとクロマチンにリクルートされる多タンパク質複合体の一部です。アセチル化はリジンの基本的な電荷を効果的に中和します。リジンは、負に帯電したDNAに対する親和性を通じてクロマチンを安定化させる役割を果たしていました。したがって、アセチル化されたヒストンはヌクレオソームの解離を促進し、クロマチンの巻き戻しが起こります。クロマチンが緩んだ状態では、DNAは転写機構にアクセスしやすくなり、発現が活性化されます。このプロセスは、脱アセチル化酵素によるヒストンアセチル基の除去によって逆転させることができます。^{[14] [16]}

2番目のプロセスは、活性化分子が対応するエンハンサー領域に結合することによってクロマチンリモデリング複合体をリクルートすることである。ヌクレオソームリモデリング複合体は、いくつかのメカニズムによってヌクレオソームを再配置し、転写機構のDNAへのアクセスを有効または無効にする。酵母のSWI/SNFタンパク質複合体は、クロマチンリモデリングを通じて多くの遺伝子の発現を制御するクロマチンリモデリング複合体の一例である。^{[14] [17]}

エピゲノミクスは、方法論と抽象的な目的の両方において、他のゲノミクス分野と多くの共通点を持っています。エピゲノミクスは、ゲノミクスにおける完全なDNAセットの研究や、プロテオミクスにおける細胞内の完全なタンパク質セットの研究と同様に、グローバルレベルでエピジェネティックな修飾を特定し、特徴付けることを目指しています。^{[1] [2]}グローバルレベルでエピジェネティック分析を実行する背後にあるロジックは、特定の遺伝子座の分析では不可能なエピジェネティックな修飾についての推論を行うことができるというものです。^{[13] [1]}他のゲノミクス分野と同様に、エピゲノミクスは、生物学、数学、コンピューターサイエンスの分野を組み合わせたバイオインフォマティクスに大きく依存しています。 ^[18]しかし、エピジェネティックな修飾は何十年も前から知られ、研究されてきましたが、バイオインフォマティクス技術のこれらの進歩によって、グローバルな規模での分析が可能になりました。現在の多くの技術は、次のセクションで説明するように、多くの場合、古い方法を利用してゲノムアッセイに適応させています。

転写、DNA複製、DNA修復といった細胞プロセスには、ゲノムDNAと核タンパク質の相互作用が関与している。クロマチン内の特定の領域は、 DNAを低配列特異性で切断するDNA分解酵素Iによる消化に極めて敏感であることが知られていた。このような過敏な部位は、RNAポリメラーゼやトポイソメラーゼI、IIとの関連から、転写活性領域であると考えられていた。^[19]

現在では、DNAse I領域に対する感受性は、DNAとヒストンの緩い結合を持つクロマチン領域に対応することがわかっています。過敏な部位は、ほとんどの場合、DNA結合転写機構が機能するためにDNAにアクセスする必要があるプロモーター領域を表します。^[20]

ヒストンの修飾は、クロマチン免疫沈降（ChIP）技術とDNAマイクロアレイを組み合わせたChIP-Chipと呼ばれる技術によって、初めてゲノムワイドなレベルで検出されました。^[13]しかし、クロマチン免疫沈降によってDNA結合転写因子やエンハンサータンパク質を単離するのではなく、対象となるタンパク質は修飾されたヒストンそのものです。まず、ヒストンは、軽い化学処理（ホルムアルデヒドなど）によって、生体内でDNAに架橋されます。次に、細胞を溶解し、超音波処理または非特異的制限酵素（ミクロコッカルヌクレアーゼなど）による処理によって、クロマチンを抽出して断片化します。次に、修飾特異的抗体を使用して、DNA-ヒストン複合体を免疫沈降させます。^{[14]免疫沈降後、DNAはヒストンから精製され、PCRによって増幅され、}蛍光タグ（Cy5、Cy3など）で標識されます。最後のステップでは、免疫沈降したDNAと免疫沈降していないDNAの両方を、固定化されたgDNAを含むマイクロアレイ上にハイブリダイゼーションします。相対的な信号強度を分析することで、ヒストンの修飾部位を特定できます。^{[21] [22]}

ChIPチップは、酵母の全体的なヒストン修飾パターンを特徴付けるために広く使用されました。これらの研究から、ヒストン修飾の機能に関する推論がなされ、転写の活性化または抑制は特定のヒストン修飾と領域によって関連していることがわかりました。この方法は酵母のエピゲノムをほぼ完全にカバーする効果的な方法でしたが、ヒトなどのより大きなゲノムでの使用は限られています。^{[13] [14]}

ヒストン修飾を真にゲノムレベルで研究するために、クロマチン免疫沈降法と他のハイスループット法が組み合わされました。具体的には、SAGE：遺伝子発現の連続解析（ChIP-SAGE）、PET：ペアエンドジタグシーケンシング （ChIP-PET）、そして最近では次世代シーケンシング（ChIP-Seq）です。ChIP-seqはクロマチン免疫沈降法と同じプロトコルに従いますが、精製DNAを増幅してマイクロアレイにハイブリダイズする代わりに、DNA断片を次世代パラレルリシーケンシングを使用して直接シーケンシングします。これは、全体的なヒストン修飾パターンとタンパク質標的部位を分析するための効果的な方法であることが証明されており、以前の方法よりも高い解像度を提供します。^{[13] [21]}

一次DNA配列を特徴付ける技術は、メチル化アッセイに直接適用することはできませんでした。たとえば、PCRや細菌クローニング技術でDNAを増幅した場合、メチル化パターンはコピーされず、情報は失われます。DNAアッセイで使用されるDNAハイブリダイゼーション技術は、放射性プローブを使用してDNA配列をマッピングおよび識別するものであり、メチル化されたDNAとメチル化されていないDNAを区別するために使用することはできませんでした。^{[23] [9]}

最も初期のメチル化検出アッセイでは、メチル化修飾感受性制限酵素が使用されました。ゲノム DNA は、同じ制限部位を認識するメチル化感受性制限酵素と非感受性制限酵素の両方で消化されました。その考え方は、部位がメチル化されている場合、メチル化非感受性酵素のみがその位置で切断できるというものです。メチル化感受性酵素から生成された制限断片のサイズをメチル化非感受性酵素のサイズと比較することで、その領域のメチル化パターンを決定することができました。この分析ステップは、PCR で制限断片を増幅し、ゲル電気泳動で分離し、対象領域のプローブを使用してサザンブロットで分析することで行われました。 ^{[23] [9]}

この技術は、ヒトの成人とヘモグロビン遺伝子座におけるDNAメチル化修飾パターンを比較するために使用されました。遺伝子の異なる領域（ガンマデルタベータグロビン）は、発達の異なる段階で発現することが知られています。^[24]遺伝子抑制におけるDNAメチル化の役割と一致して、高レベルのDNAメチル化に関連する領域は活発に発現していませんでした。^[25]

この方法は、全体的なメチル化パターン、つまり「メチローム」の研究には適さないという制限がありました。特定の遺伝子座内であっても、対応するメチル化感受性および非感受性制限アッセイを持つ制限部位のみが有用な情報を提供できるため、真のメチル化パターンを完全には表していませんでした。制限酵素によるDNAの不完全な消化によって偽陰性の結果が生成されると、さらに複雑な問題が発生する可能性があります。^[9]

大規模なDNAメチル化プロファイリングは、制限ランドマークゲノムスキャン（RLGS）技術によって初めて可能になりました。遺伝子座特異的DNAメチル化アッセイと同様に、この技術は消化メチル化感受性酵素を介してメチル化されたDNAを識別します。しかし、より広い範囲で特徴付けを可能にしたのは、2次元ゲル電気泳動の使用でした。 ^[9]

しかし、真に高解像度でゲノム全体のDNAメチル化が可能になったのは、マイクロアレイと次世代シーケンシング技術の登場によるものでした。^[26] RLGSと同様に、エンドヌクレアーゼの要素はこの方法で保持されていますが、新しい技術と組み合わせられています。そのようなアプローチの1つが、差動メチル化ハイブリダイゼーション（DMH）です。これは、1セットのゲノムDNAをメチル化感受性制限酵素で消化し、並行するDNAセットは消化しないものです。その後、両方のDNAセットを増幅し、それぞれを蛍光色素で標識して、2色アレイハイブリダイゼーションに使用します。特定の遺伝子座のDNAメチル化レベルは、2つの色素の相対的な強度比によって決まります。次世代シーケンシングをDNAメチル化アッセイに適応させることで、アレイハイブリダイゼーションに比べていくつかの利点が得られます。シーケンスベースの技術は、対立遺伝子特異的DNAメチル化に対してより高い解像度を提供し、より大きなゲノムに対して実行することができ、適切に機能するためにCpG密度に基づいた調整を必要とするDNAマイクロアレイの作成を必要としません。^[9]

亜硫酸水素塩シーケンシングは、非メチル化シトシンのみを化学的に変換することで、標準的な DNA シーケンシング技術で識別できるようにする。 亜硫酸水素ナトリウムとアルカリ処理により、メチル化シトシンはそのまま残したまま、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換することでこれを実現する。その後、未処理 DNA と亜硫酸水素ナトリウム処理 DNA を増幅してシーケンシングすることで、メチル化部位を識別できる。亜硫酸水素塩シーケンシングは、従来の制限法と同様に、全ゲノムシーケンシング技術が利用可能になるまで、特定の遺伝子座のメチル化パターンに限定されていた。しかし、従来の制限法とは異なり、亜硫酸水素塩シーケンシングはヌクレオチドレベルでの解像度を提供した。^{[23] [9]}

亜硫酸水素塩法の限界としては、シトシンからウラシルへの不完全な変換が挙げられ、これが偽陽性の原因となる。さらに、亜硫酸水素塩処理はDNAの劣化も引き起こすため、亜硫酸水素ナトリウムを除去するための追加の精製工程が必要となる。^[9]

次世代シーケンシングは、ゲノム全体のメチル化解析において亜硫酸水素塩シーケンシングを補完するのに適しています。これにより、メチル化パターンを単一ヌクレオチドレベルで可能な限り最高の解像度で決定できるようになりましたが、亜硫酸水素塩処理されたDNAの配列の複雑さが減少するため、アセンブリステップにはまだ課題が残っています。リード長の増加は、この課題に対処することを目指しており、全ゲノムショットガン亜硫酸水素塩シーケンシング（WGBS）を実行できるようにします。イルミナゲノムアナライザープラットフォームを使用したWGBSアプローチは、すでにシロイヌナズナで実装されています。^[9]亜硫酸水素塩シーケンシングに基づく縮小表現ゲノム法も存在し、^{[27] [28]}特にゲノムサイズの大きい種に適しています。^[29]

クロマチンアクセシビリティは、ゲノムの領域が転写または転写因子の結合に対してどれだけ「アクセス可能」または「オープン」であるかの尺度です。アクセスできない領域（つまり、ヌクレオソームに結合しているため）は細胞によって積極的に転写されませんが、オープンでアクセス可能な領域は活発に転写されます。^[30]クロマチンアクセシビリティの変化は、細胞またはコンテキスト固有の遺伝子発現を制御する重要なエピジェネティック制御プロセスです。^[31] MNase-seq、DNase-seq、ATAC-seq、またはFAIRE-seqなどのアッセイは、細胞のアクセス可能なクロマチンランドスケープを理解するために日常的に使用されています。これらすべての方法の主な特徴は、ヒストンに結合しているDNA配列と結合していないDNA配列を選択的に分離できることです。これらの配列は、相対的な位置を特定できる参照ゲノムと比較されます。^[32]

MNase-seqとDNase-seqはどちらも同じ原理に従っており、核酸を標的とする溶解酵素を使用して、ヌクレオソームやその他のタンパク質因子によって結合されていないDNA鎖を切断し、結合した断片は保護され、回収して分析することができます。活性な結合していない領域は破壊されるため、次世代シーケンシング技術でシーケンスし、参照と比較することによって間接的にしか検出できません。MNase-seqは、標的配列の反対側の鎖で一本鎖切断を生成する微小球菌ヌクレアーゼを利用します。^[33] DNase-seqは、非特異的な二本鎖切断エンドヌクレアーゼであるDNase Iを使用します。この技術は、ヌクレオソームフリー領域がDHS（DNase I過敏性部位）として分類されるほど広く使用されており、^[34] ENCODEコンソーシアムのゲノムワイドクロマチンアクセシビリティ解析の選択方法となっています。^[35]この技術の主な問題は、切断分布が偏る可能性があり、^[36]結果の品質が低下することです。

FAIRE-seq (ホルムアルデヒド支援による調節エレメントの分離) では、まず DNA をヌクレオソームで架橋し、次に超音波処理で DNA を切断する必要があります。遊離断片と結合断片は、従来のフェノールクロロホルム抽出法で分離されます。これは、タンパク質画分が中間相に留まり、結合していない DNA が水相に移行してさまざまな方法で分析できるためです。^[37]超音波処理ではランダムに切断されるため、いかなるバイアスも受けません。また、断片の長さが長い (200～700 nt) ため、この手法はより広い領域に適していますが、単一のヌクレオソームを分離することはできません。^[32]ヌクレアーゼベースの方法とは異なり、FAIRE-seq では転写活性部位を直接特定でき、サンプルの準備が簡単になります。^[38]

ATAC-seqはTn5トランスポザーゼの活性に基づいています。トランスポザーゼはゲノムにタグを挿入するために使用され、タンパク質因子でカバーされていない領域に高い頻度で挿入されます。その後、タグはPRCやその他の分析ツールのアダプターとして使用されます。^[39]

単一分子リアルタイムシーケンシングにおけるポリメラーゼ感度により、ポリメラーゼがシーケンシング対象のDNA分子に沿って移動するにつれて、科学者はメチル化などのエピジェネティックなマークを直接検出することが可能になった。^[40]いくつかのプロジェクトでは、細菌のゲノム全体のエピジェネティックデータを収集できることが実証されている。^{[41] [42] [43] [44]}

ナノポアシーケンシングは、塩基修飾（メチル化など）に応じた電解電流信号の変化に基づいています。ポリメラーゼがssDNAの細孔への進入を仲介します。イオン電流の変化は細孔の一部によって変調され、その結果生成された差が記録されてCpGの位置が明らかになります。固体ナノポアのおかげで、電流が細孔の高電場領域を通過する際にわずかに影響を受ける場合でも、ヒドロキシメチル化とメチル化の区別が可能です。 ^{[45]参照として、} PCRプロセス後にコピーされたメチル化部位を示さない増幅DNAが使用されます。^[46] Oxford Nanopore Technologies MinIONシーケンサーは、隠れマルコフモデルによれば、その修飾の信号を増強する化学処理を行わなくても、メチル化されていないシトシンとメチル化されたシトシンを区別できる技術です。データは通常、設定された時間内にピコアンペア単位で記録されます。他の装置としてはNanopolishとSignaAlignがある。前者はリード内のメチル化の頻度を表し、後者は全てのリードの合計から導かれたメチル化の確率を与える。^[47]

単一分子リアルタイムシーケンシング（SMRT） は、単一分子 DNA シーケンシング法です。単一分子リアルタイムシーケンシングでは、ゼロモード導波路（ZMW）を利用します。単一の DNA ポリメラーゼ酵素が、テンプレートとして単一の DNA 分子とともに ZMW の底部に結合します。4 つの DNA 塩基のそれぞれが、4 つの異なる蛍光色素のいずれかに結合します。ヌクレオチドが DNA ポリメラーゼによって取り込まれると、蛍光タグが切断され、検出器がヌクレオチドの取り込みの蛍光信号を検出します。シーケンシングが行われると、ポリメラーゼ酵素の速度論は、メチル化領域またはその他の塩基修飾に遭遇するとシフトします。酵素が化学的に修飾された塩基に遭遇すると、酵素は一意に識別できる方法で減速または加速します。SMRT シーケンシングの蛍光パルスは、発光スペクトルだけでなく、持続時間や連続パルス間の間隔によっても特徴付けられます。パルス幅とパルス間隔 (IPD)として定義されるこれらの指標は、DNA ポリメラーゼの速度論に関する貴重な情報を追加します。パルス幅は、ヌクレオチド結合後から蛍光体の放出までのすべての速度論的ステップの関数であり、IPD はヌクレオチド結合とポリメラーゼの転座の速度論によって決定されます。

2010年に科学者チームは、N6-メチルアデノシン、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシシトシンなどのDNAテンプレート内の修飾ヌクレオチドを直接検出するための単一分子リアルタイムシーケンシングの使用を実証しました。これらのさまざまな修飾はポリメラーゼの速度論に異なる影響を与え、それらを区別することができます。^[48]

2017年に別のチームが、亜硫酸水素塩変換と第三世代の単一分子リアルタイムシーケンシングを組み合わせた方法を提案しました。これは単一分子リアルタイム亜硫酸水素塩シーケンシング（SMRT-BS）と呼ばれ、PCRアンプリコンのサブクローニングを必要とせずに、高度な増殖と長い読み取り長（1.5kb）が可能な正確な標的CpGメチル化解析方法です。^[49]

遺伝子発現に影響を与えるさまざまなヌクレオソーム状態の最初の数学モデルは、1980年代に導入されました[ref]。その後、このアイデアはほとんど忘れ去られましたが、実験的証拠により、共有結合ヒストン修飾がエピジェネティックコードとして役割を果たす可能性があることが示されました。^[50]その後数年間で、ハイスループットデータにより、エピジェネティック修飾の豊富さとクロマチン機能との関係が明らかになり、これらのパターンの出現、維持、変化に関する新しい理論モデルが生まれました。^{[51] [52]}これらのモデルは通常、1次元格子アプローチの枠組みで定式化されます。^[53]

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• ギブソン G、ミューズ SV (2009)。ゲノム科学入門(第 3 版)。サンダーランド: Sinaeur Associates。ISBN 978-0-87893-236-8。
• Russell PJ (2010) 。iGenetics: A Molecular Approach (第3版)。サンフランシスコ: Pearson Benjamin Cummings。ISBN 978-0-321-56976-9。