インテグラーゼ阻害剤の発見と開発

ヒト免疫不全ウイルス ( HIV ) の最初の症例は、1980 年代初頭に米国で報告されました。この病気を治療するための多くの薬が発見されましたが、ウイルスの変異と薬への耐性により開発が困難になっています。インテグラーゼは、レトロウイルス DNA を宿主細胞のゲノムに組み込むウイルス酵素です。インテグラーゼ阻害剤は、 HIV の治療に使用される新しいクラスの薬です。最初のインテグラーゼ阻害剤であるラルテグラビルは2007 年に承認され、他の薬は 2011 年に臨床試験中でした。

体は免疫系を使って細菌、ウイルス、その他の病原体から身を守っていますが、免疫系が機能しなくなると免疫不全疾患が発生します。そのような疾患の1つが後天性免疫不全症候群（エイズ）で、最も一般的な原因はヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感染です。^{[1] HIVには、} HIV-1とHIV-2という 2つの密接に関連したタイプが特定されています。HIV-2はインドと西アフリカで蔓延していますが、HIV-1の方が毒性が強く、世界中でエイズの最大の原因となっています。患者によっては結果が異なりますが、ほとんどの場合、HIVに感染した人はエイズを発症し、最終的には日和見感染症や癌で死亡します。レトロウイルスゲノムへの統合は、遺伝子発現とウイルス複製に不可欠です。ウイルスゲノムはウイルス逆転写酵素によって感染細胞のDNAに逆転写され、次にDNAはウイルスインテグラーゼの助けを借りて宿主細胞の染色体に組み込まれます。 RNA転写産物は組み込まれたウイルスDNAから生成され、ウイルスタンパク質の合成を指示するmRNAとして、また後に新しいウイルス粒子のRNAゲノムとして機能します。ウイルス粒子は細胞膜から出芽して細胞から脱出し、それぞれが膜エンベロープに囲まれています。^[2]

この過程ではHIV-1インテグラーゼが不可欠であり、そのため抗エイズ薬設計の非常に有望なターゲットである。HIV-1インテグラーゼには細胞内同等物が知られていないため、選択的な薬物設計が可能である。^{[3]多くのインテグラーゼ阻害剤が発見され設計されたが、さらに開発され、}臨床試験の第2相または第3相まで進んだ分子はわずかである。ラルテグラビル（ブランド名アイセントレス）は、2007年10月に米国食品医薬品局（FDA）から、2007年12月にEMEA（現EMA）から迅速承認を受けた。 ^{[4] [5]} ラルテグラビルは、少なくとも3種類の抗レトロウイルス薬に曝露し、多剤耐性を示したHIV-1感染成人に対する抗レトロウイルス薬（ARV）として販売された。一般に、インテグラーゼ阻害剤には、インテグラーゼ鎖移動阻害剤（INSTI）とインテグラーゼ結合阻害剤（INBI）の2つの主要なグループがある。 INSTI はインテグレーション前複合体 ( PIC ) と宿主 DNAの結合を抑制し、INBI はインテグラーゼとウイルス DNA の結合を抑制します。ラルテグラビルは、HIV-1 と HIV-2 の両方の複製を阻害する INSTI インテグラーゼ阻害剤です。これは、これまでに知られている他のインテグラーゼ阻害剤よりも強力であり、副作用も少ないです。ラルテグラビル、エルビテグラビル、ドルテグラビル、ビクテグラビルは、HIV 感染症の治療に使用されている唯一の HIV-1 インテグラーゼ阻害剤です S/GSK1349572。^{[4] [6] [7] [8]}

HIV-1インテグラーゼ（IN）は、レトロウイルスの複製機構における重要な酵素です。^[9]レトロウイルスの複製に必要なイベントである、ウイルスにコード化されたDNAを宿主染色体に移す役割を担っています。^[10] INは宿主細胞内に相当するものがないため、インテグラーゼ阻害剤は正常な細胞プロセスを妨げないため、治療指数は高くなります。 ^[11]

INは、機構的にも構造的にもポリヌクレオチド転移酵素10のスーパーファミリーに属し、32kDaのタンパク質を形成する288個のアミノ酸で構成されています。^[9]レトロウイルスは、その酵素（プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ）を、 INをコードする3'末端を持つPOL遺伝子でコードしています。^[11]

INは3つの構造的に独立した機能ドメインから構成されている（図1参照）。^[9]

1. N末端ドメイン（NTD）はアミノ酸1～50を包含し、2つのヒスチジン残基（His12とHis16）と2つのシステイン残基（Cys40とCys43）を含み、これらはすべて完全に保存されており、HHCCジンクフィンガーモチーフを形成します。^{[9] [12]}これらの4つの残基のいずれかの単一変異は、IN酵素活性を低下させます。^[11] HHCCジンクフィンガーモチーフは、 INモノマーごとに1つの亜鉛原子をキレートします。NTDは高次の多量体形成に必要であり、それがその主な役割であると思われます。^{[12] [13]}多量体化には、フォールドを安定化する亜鉛原子が必要です。^[12]

2.アミノ酸51-212を含む触媒コアドメイン（CCD）にはINの活性部位が含まれていますが、NTDとCTD（C末端ドメイン）がなければ統合を触媒できません。 ^[11] CCDには、D64、D116、E152という3つの絶対的に保存された負に帯電したアミノ酸が含まれています。^[9]これらのアミノ酸は、二価金属イオン（Mg ²⁺またはMn ²⁺）を配位するDDEモチーフを形成します。これらの金属イオンは、統合の触媒に不可欠です。^{[12] [13]} CCDは、柔軟なループでつながれた5つのβシートと6つのαヘリックスを持つ混合βとα構造を持っています。 ^{[12]柔軟なループは、ウイルスDNAの}3'処理と、統合反応の2つの重要なステップである鎖移動（STF）反応に必要な構造変化を可能にします。^[9] CCDはこれらのステップに必須であり、DDEモチーフのいずれかの残基を置換するとINの活性が劇的に阻害される。^[12]

3.アミノ酸213～288を含むC末端ドメイン（CTD）はDNAに非特異的に結合し、NTDおよびCCDとの相互作用はIN 3'-処理および鎖転移活性に必要である。^{[11] [12]} CTDは3つのドメインの中で最も保存性が低い。^[12] INは多量体として機能し、3'-処理ステップには二量体化が必要であり、四量体INが鎖転移反応を触媒する。^[要出典]

HIV-1の統合は、2つの触媒反応を含む多段階のプロセスを経て起こります。プロウイルスDNA末端の3'エンドヌクレアーゼによる処理（3'処理と呼ばれる）と、3'処理されたウイルスDNAの細胞DNAへの統合（鎖転移と呼ばれる）です。 ^{[6] 3'処理では、INはウイルスDNAの}長末端反復配列（LTR）のどちらかの末端にある短い配列に結合し、エンドヌクレオチド切断を触媒します。これにより、LTRの3'末端のそれぞれからジヌクレオチドが除去されます。切断されたDNAは、統合または鎖転移の基質として使用されます。^[9]鎖転移は、2つの新しく処理されたウイルス3'-DNA末端の3'ヒドロキシ基が宿主標的DNAのホスホジエステル骨格に直接求核攻撃するエステル交換反応です。[ ^14]これにより、ウイルスDNAが感染細胞のゲノムに共有結合で挿入されます。鎖転移はウイルスDNA分子の両端で同時に起こり、2つの反対の挿入点の間には正確に5塩基対のオフセットがある。^{[9]統合反応は、ウイルスDNAの}5'末端から不対二ヌクレオチドを除去し、ウイルスと標的DNA分子の間に生じた一本鎖ギャップを修復し、3'末端を宿主DNAの5'末端に連結することで完了する。^{[9] [14]}二価金属、Mg ²⁺またはMn ²⁺は、3'処理および鎖転移ステップ、およびINを特定のウイルスドナーDNA上に組み立てて、いずれかの機能を実行できる複合体を形成するために必要である。ヒト細胞におけるマグネシウム（Mg ²⁺）の豊富さはマンガン（Mn ²⁺）の1,000,000倍であるため、マグネシウムは統合のためのより入手しやすい二価補因子であると思われる。^[6]

インテグラーゼを標的とする方法はいくつかあるが、鎖転移阻害は最も直感的に明らかで、現在までに容易に追求されている。他の標的としては、例えば、IN の活性部位を超えたタンパク質ドメインが挙げられる。これらのドメインはウイルスまたは宿主 DNA と相互作用し、酵素への結合に重要である。これらの結合を破壊または除去することで、酵素の機能を妨げることが可能である。PIC は宿主細胞内の多量体タンパク質構造であり、ウイルスと宿主の両方のタンパク質から構成される。インテグラーゼは PIC のウイルス成分の一部である。PIC のウイルスおよび宿主タンパク質は、酵素の固有の活性を調節し、PIC を核に送り込み、ウイルス DNA を宿主ゲノムの転写活性領域に直接組み込むと考えられている。PIC から特定のタンパク質を排除することができれば、ウイルスが宿主ゲノムに組み込む能力を阻害することができる。レトロウイルス RNA が DNA に転写され、宿主細胞のゲノムに組み込まれるプロセスを図 2 に示す。^[8]

Mg ²⁺と Mn ²⁺は統合段階において重要な補因子です。これらの補因子を不活性化すると (例えばキレート化により)、IN の機能障害を引き起こします。この概念により、研究者は効率の高い IN 阻害剤 (INI) を設計および開発する機会を得られます。実際、現在研究されているすべての小分子 HIV-1 INI には、酵素の活性部位にある 2 つの二価マグネシウムイオンを調整する構造モチーフが含まれています。^[6]

ラルテグラビルとエルビテグラビルは、インテグラーゼに対する作用機序が同じで、Mg ²⁺イオンの活性部位に結合する。^[8]競合阻害剤は、3'末端処理を阻害するために、ウイルスDNAと直接競合してインテグラーゼに結合する。^{[15]これにより、阻害剤は活性部位が標的DNAに結合するのを完全にブロックする。この阻害は}鎖移動阻害と呼ばれる。^[8]

水晶体上皮由来増殖因子（LEDGF/p75）は、インテグラーゼに結合する宿主タンパク質であり、ウイルスの複製に極めて重要である。作用機序は正確にはわかっていないが、証拠はLEDGF/p75がインテグラーゼを誘導して、ウイルスDNAを宿主ゲノムの転写活性部位に挿入することを示唆している。このタンパク質の阻害剤はすでに開発され、特許を取得している。これらは標的特異性が高く、耐性発現の可能性が低いと考えられる。^[8]

INIの別のクラスは、V-165などのIN結合阻害剤（INBI）である可能性があります。V-165は、ウイルスDNA合成に明らかな影響を及ぼさずに統合を阻害することが示されている化合物です。作用機序を研究したところ、V-165はウイルスDNA-IN複合体の形成を阻害することが示されました。その阻害作用により、IN結合阻害剤として分類されます。スチリルキノリンなどの他の化合物は、IN結合のLTR基質と競合することで同様のメカニズムを共有しています。^[16]

INSTIは、触媒トライアド、すなわちDDEモチーフによって配位されている二価金属イオン（Mg ²⁺ ）をキレートすることにより、DNA末端に関連したINに強く特異的に結合します。 ^[9] DDEモチーフはINのCCDに位置し、酵素の活性部位であるため、INSTIはいわゆる活性部位阻害剤です。INSTIは、3'ウイルスDNA末端の処理後に生じる立体配座にのみ存在する、INのDDEモチーフに近い特定の部位に結合します。ウイルスDNAは、阻害剤結合部位の一部を形成する可能性があります。この結合は、特定のインテグラーゼ-ウイルスDNA複合体の阻害を意味するため、アロステリック阻害の一種です。 ^[12]これにより、鎖転移反応が選択的に阻害されますが、3'処理反応には大きな影響はありません。^[9]そのため、INSTIはより特異的で標的DNA結合部位に選択的に結合し、ドナー結合部位と標的結合部位の両方に結合できる二機能性阻害剤よりも毒性が低い可能性がある。^[12]

INBIもINに結合しますが、その作用機序は不明であるため、結合の詳細を説明することはできません。^[16]

インテグラーゼ結合には2つの構造成分が必要である。活性部位近くの疎水性ポケットに埋め込まれる疎水性ベンジル部分と、むしろ親水性の領域で2つのMg 2+イオンと結合し、阻害剤をタンパク質表面に固定するキレートトライアドで ある（図³を参照）。^[17]実際、すべての強力なインテグラーゼ阻害剤は、3'末端結合効力を維持するために重要な置換ベンジル成分を有する。ベンジル基を除去すると阻害機能が妨げられる。^{[15]したがって、}親油性置換基は鎖転移阻害に有益であり、特にチオフェニル、フラニル、および（チオフェン-2-イル）フェニル置換基が有益である。ヘテロ芳香族アミンおよびアミドも3'プロセシング阻害作用を増強する。^[6]

カテコールベースのIN阻害剤を研究したところ、ビスヒドロキシル化アリール環との平面関係を維持すると効力が増すことが観察されました。阻害活性は、メタクロロ置換基を含めることでさらに最適化され、ベンジル基と隣接する疎水性ポケットとの相互作用が強化されます（図4：構造AGを参照）。^[8]

ベンジル置換ヒドロキシル基（図4H）は（図4の構造Jと比較して）金属キレート能力を向上させるが、メトキシ基（I）は追加のメチル基と触媒金属との立体的衝突のためにその効力ははるかに低くなる。^[15]

ジケト誘導体を研究する際、図4の構造Kの中央のピロール環は、さまざまな置換パターンを持つ一連の芳香族系に置き換えられました。これにより、ベンジルとジケト酸（DKA）部位鎖の相対的な配向が最適化されました。図4の構造Lは、効力が100倍増加しました。^[18]

Benard et al (2004)は、キノリンサブユニットと、アミド、ヒドラジド、尿素、ヒドロキシプロプ-1-エン-3-オン部分などの官能基化スペーサーで結合した補助芳香族環を持つINIを合成した。彼らは、アミド基を含む誘導体が最も有望であることを発見した。^{[18] [19]}一連のスチリルキノンを合成することにより、研究者らは、キノリンサブユニットのC-7のカルボキシル基、C-8のヒドロキシル基、および補助フェニル環（図4：構造M）が阻害に必要であるが、環の変化は許容されることを発見した。補助フェニル環の2つのヒドロキシル基も阻害効力に必要である。^[18]

HIVインテグラーゼ触媒に関する重要な構造情報が乏しいため、その阻害のための正確なファーマコフォアを見つけることは困難です。Wangら(2010) は、インテグラーゼと逆転写酵素 (RT) の両方に焦点を当てた二重阻害剤スキャフォールドの SAR とファーマコフォアを研究することで、抗インテグラーゼ活性を観察できることを期待しました。HIVインテグラーゼ阻害剤の SAR を研究することで、最適なインテグラーゼ阻害には、ファーマコフォアに特定の長さの位置特異的 (N-1) DKA が必要であることがわかりました。鎖転移を選択的に阻害する DKA 機能またはその複素環式 バイオアイソスターは、インテグラーゼ阻害剤のすべての主要な化学型に存在するようです。 ^[17]上記の SAR の議論で詳述されているように、INI の 2 つの必要な構造成分は、ベンジル疎水性部分と、Mg ²⁺イオンに結合するキレートトライアドです。トライアドが結合するためには、Mg ²⁺イオンがイオン化されている必要がある（図5参照）。したがって、ファーマコフォアバイオアイソスターもイオン化されている必要があり、ベンジルファーマコフォアバイオアイソスターは非常に疎水性でなければならない。^{[11] [17]}

しかし、臨床開発でのこれまでの成功（ラルテグラビル）にもかかわらず、詳細な結合モデルが欠如しているため、インテグラーゼ阻害剤の設計を構造化することは困難であることが判明しています。サリチル酸とカテコールのファーマコフォアが統合されると、新しい化学骨格が作成されました。サリチル酸の隣接するヒドロキシル基とカルボキシル基は、金属イオンと結合してファーマコフォアとして機能する可能性があります。ポリヒドロキシル化芳香族阻害剤は、主に鎖転移反応と3'プロセシングに対して活性であり、両方のステップをターゲットとするメカニズムを示唆しています。これは化合物の非常に重要な部分であり、INの活性部位の二価金属に結合するために使用でき、鎖転移特異的阻害剤に耐性のあるウイルス株に対して効果的です。^{[6] [17]}

INSTI変異の60以上のバリエーションが、生体内および試験管内耐性を引き起こすことが発見されています。これらの変異と耐性の発達により、阻害剤はウイルスに対して効果が低下します。^[9] INIの耐性は、他の抗レトロウイルス薬の耐性に対応します。第一に、IN耐性は、INI感受性を低下させる一次変異と、ウイルス感受性をさらに低下させる、および/またはウイルスの適応度の低下を修復する二次変異の組み合わせによって引き起こされます。第二に、INI耐性には遺伝的障壁があり、臨床的なINI活性の喪失に必要な変異の数によって定義されます。第三に、 INI間には広範囲ではあるが不完全な交差耐性があります。 ^[13] アミノ酸残基140〜149を含むループは触媒コアドメインにあり、前述のようにIN機能に重要です。このループは柔軟性があり、その役割はよくわかっていませんが、DNA結合にとって重要であり、その機能は不可欠であると考えられています。この耐性は、このINコード領域の変異内に現れます。^[9] ラルテグラビルとエルビテグラビルに対する耐性は、主に同じ 2 つの変異経路によるものですが、それぞれの薬剤には他の主要な変異も関与しています。^[10]一部の変異は、他の変異よりも薬剤に対する耐性を大幅に高めます。たとえば、最も一般的な変異経路の 1 つは、2 番目に一般的な変異経路よりもラルテグラビルに対する耐性を最大 100 倍高めます。^[9] インテグラーゼ阻害剤 S/GSK1349572 に対する耐性はまだ開発中であり、耐性は完全には特徴付けられていません。ラルテグラビルとエルビテグラビルの主要な変異と一緒に評価したところ、交差耐性は見られませんでした。つまり、薬剤耐性ウイルスに対して有効である可能性があります。^[7] ラルテグラビルは腸管吸収が限られているため、高用量を処方しても耐性を克服することはできません。この薬理学的欠点を克服し、ラルテグラビル耐性ウイルスを標的とするのに十分な血漿濃度を得るためには、より新しい薬剤が必要です。^[7]

HIVに感染した患者の治療を改善する新しい方法の模索は絶え間なく続いています。1980年代から蓄積されてきた抗レトロウイルス薬開発の経験を考慮すると、新しい強力な抗レトロウイルス薬のクラスとしてのINSTIの登場は、HIV治療の新時代の到来を告げるものです。メルク・シャープ・アンド・ドーム社によるラルテグラビルの発見により、INSTIによる効果的な治療の開発が達成されました。^[12] 2007年12月、欧州委員会により条件付き販売承認が付与され、これは欧州連合全域で有効でした。^[20] 2009年にこの承認は完全な販売承認に変更され、同年、FDAは承認を迅速承認から通常承認に変更し、この薬を第一選択の抗レトロウイルス治療薬としてリストしました。^{[12] [21]} 2番目のINSTI薬であるエルビテグラビルは、日本たばこ産業によって特定され、2005年に臨床試験が開始されました。2011年時点では、この薬はまだ第3相臨床試験の段階にあり、治療経験のある被験者ではラルテグラビルと比較されており、多剤治療の一環として未治療の被験者での第2相開発段階でもあります。^[12] S/GSK1349572は、ViiV/Shinongiによって発見されたインテグラーゼ阻害剤で、2011年に臨床試験の第3相に入っていました。この新薬は有望で、忍容性も良好で、これまでのところラルテグラビルとエルビテグラビルの両方よりも良い結果を示しています。^[22]

ラルテグラビルとエルビテグラビルに対する耐性の問題があったため、科学者は2009年にメルク社が開発したMK-2048などの新しい第二世代インテグラーゼ阻害剤の研究を開始しました。これは、ラルテグラビルとエルビテグラビルに対する変異を含むウイルスに対して依然として有効性を維持しているプロトタイプの第二世代INSTIです。MK-2048の作用機序とSARは他のINSTIと同じであり、MK-2048の構造は、必須のファーマコフォアを強調して図6に示されています。^{[23] [24]}

上で述べた薬剤は有望ではあるものの、開発にはまだ長い道のりがあり、これらの薬剤の有効性、安全性、作用機序についてはまだ多くのことが分かっていません。^[7]

• ラルテグラビル
• エルビテグラビル
• インテグラーゼ
• インテグラーゼ阻害剤
• HIV
• 逆転写酵素
• MK-2048
• ドルテグラビル
• ビクテグラビル