スポットテスト（地衣類）

地衣類学におけるスポットテストは、地衣類の識別に用いられるスポット分析である。これは、地衣類のさまざまな部分に化学試薬を一滴垂らし、化学薬品の塗布に伴う色の変化（またはその欠如）を記録することによって行われる。このテストは、地衣類の種の二分法キーで日常的に使用されており、地衣類によって生成される地衣類生成物（二次代謝産物）の幅広い範囲と、分類群間のそれらの独自性を利用している。このように、スポットテストは地衣類のさまざまな部分における化学物質の有無を明らかにする。これは、1866年にフィンランドの地衣類学者ウィリアム・ニーランダーによって、種の識別に役立てる方法として初めて提案された。^[1]

一般的なスポットテストには、10% KOH水溶液 (K テスト)、漂白剤または次亜塩素酸カルシウムの飽和水溶液(C テスト)、または 5% アルコール性パラフェニレンジアミン溶液 (P テスト) を使用する 3 つの方法があります。色の変化は、地衣類に特定の二次代謝産物が存在するために起こります。識別に関する重要な参考文献では、化学スポットテストの結果が地衣類の種を決定するための主要な特徴となっています。特定の種を区別するなど、特定の状況で使用される、あまり使用されないが用途が限定されたスポットテストが他にもいくつかあります。反応の視認性を高めるためにろ紙を使用する、顕微鏡で調べるなどの手法のバリエーションにより、異なる地衣類の種類や色素沈着に対応し、結果は通常、観察された物質と反応を示す短いコードで要約されます。紫外線(UV) 照射などの他の診断方法は、地衣類の代謝産物を識別し、種を区別するのに役立ちます。これは、一部の物質がUV 下で蛍光を発するため、近縁種の区別に役立つためです。

地衣類の識別には4つのスポットテストが最も一般的に使用されます。^[3]

Kテストの試薬は、水酸化カリウム（KOH）の水溶液（10～25%）ですが、KOHがない場合には、10%水酸化ナトリウム（NaOH、苛性ソーダ）水溶液で、ほぼ同じ結果が得られます。^[4] 10% KOH溶液は、約6か月から1年間有効性を維持します。^[5]このテストは塩の形成に依存しており、分子内に少なくとも1つの酸性官能基が存在する必要があります。構造の一部としてキノンを含む地衣類化合物は、暗赤色から紫色を生成します。 化合物の例には、アントラキノン、ナフトキノン、およびテルフェニルキノンなどの色素が含まれます。 Kテストと一部のデプシド（アトラノリンとタムノリン酸を含む）、および多くのβ-オルシノールデプシドンでは、黄色から赤色が生成されます。 対照的に、キサントン、プルビン酸誘導体、およびウスニン酸は反応しません。^[4]

広く分布し、Kに陽性反応を示す地衣類生成物を持つ一般的な地衣類には、パリエチン（アントラキノン）に起因するK+（赤紫色）のXanthoria parietinaや、ジデプシド化合物であるバエオミセス酸に起因するK+（黄色）のDibaeis baeomycesなどがある。^[6]

このテストでは、次亜塩素酸カルシウム（漂白剤）の飽和溶液、または次亜塩素酸ナトリウムの希釈溶液（通常は5.25%を使用）、または希釈していない家庭用漂白剤を使用します。これらの溶液は24～48時間以内に分解するため、通常は毎日交換します。日光にさらされるとさらに急速に分解するため（1時間未満）、暗い色のボトルに保管することをお勧めします。これらの溶液の分解を促進する他の要因としては、熱、湿度、二酸化炭素があります。^[7]

Cテストで典型的に観察される色は、赤とオレンジがかったローズです。赤色の反応を引き起こす化学物質には、アンジア酸、エリスリン、レカノール酸などがあり、オレンジがかった赤色の反応を引き起こす化学物質には、ギロフォリン酸があります。^{[8]まれに、ジヒドロキシ}ジベンゾフランとの反応により、エメラルドグリーンが生成されます。 ^{[9]化学物質}ストレプシリンなど。^[8]このテストで生成されるもう1つのまれな色は黄色で、これはジベンゾフランウスニン酸の結果として、Cladonia portentosa^{で観察されます。 [10]}

Cに陽性反応を示す地衣類生成物を持つ、一般的で広く分布する地衣類には、キサントンチオファン酸のためC+（オレンジ）であるLecanora expallensや、ジデプシドジプロシステス酸のためC+（赤）であるDiploschistes muscorumなどがある。^[10]

これはPテストとしても知られています。パラフェニレンジアミン（PD）の1～5％エタノール溶液を使用します。これは、化学物質の結晶数個にエタノール（70～95％）を一滴垂らすことによって作られます。これにより、約1日持続する不安定で光に敏感な溶液が得られます。^[11]この溶液の代替形態であるシュタイナー溶液は、より長持ちしますが、色反応はそれほど強くありません。通常、1グラムのPD、10グラムの亜硫酸ナトリウム、0.5ミリリットルの洗剤を100ミリリットルの水に溶かして作られます。最初はピンク色ですが、時間が経つにつれて溶液は紫色になります。シュタイナー溶液は数か月間持続します。^[5]フェニレンジアミンはアルデヒドと反応して、次の反応に従ってシッフ塩基を生成します。 ^[9]

R−CHO + H ₂ NC ₆ H ₄ −NH ₂ → R−​​CH=NC ₆ H ₄ −NH ₂ + H ₂ O

この反応の生成物は黄色から赤色です。ほとんどのβ-オルシノールデプシドンと一部のβ-オルシノールデプシドは陽性反応を示します。^[11] PD試験は、K+黄色または赤色反応を起こす物質に対する高い特異性で知られており、より単純ですが決定的ではないK試験に取って代わりました。^[12] PDは粉末でも溶液でも有毒であり、PDと接触した表面（皮膚を含む）は変色します。^[13]

リンに陽性反応を示す地衣類産物を持つ、一般的で広く分布する地衣類には、ジデプシドアトラノリンのためPD+（黄色）であるParmelia subrudectaや、デプシドンフィソダリン酸のためPD+（オレンジ色）であるHypogymnia physodesなど^{がある。 [14]}

このスポットテストは、K で藻体を濡らし、その直後に C を塗布することで実施できる。最初に K を塗布すると、デプシドおよびデプシドンのエステル結合が加水分解により分解される。別のヒドロキシル基に対してメタ位にあるフェノール性水酸基が放出されると、C を塗布すると赤色からオレンジ色になる。^[15]アレクトロン酸およびフィゾドン酸はこの色を生成し、ピクロリケン酸が存在すると紫色になる。CK テストは、化学物質の塗布順序を逆にするあまり一般的ではないバリエーションである。これは、Cladonia floerkeanaに存在するバルバチン酸またはディフラクタ酸によって生成されるオレンジ色をテストする特別な場合に用いられる。^[8]ルゴールヨウ素は、特定の種の識別に役立つ可能性がある別の試薬である。^[16]

Hypogymnia tubulosaはデプシドンフィソジン酸によりKC+（オレンジピンク）の色をした地衣類であり、 Cetrelia olivetorumはデプシドンアレクトロン酸によりKC+（ピンク赤）の色をした地衣類である。 ^[10]

いくつかのスポット テストは適用範囲が限られているためあまり使用されませんが、特定の地衣類の代謝産物を検出する必要がある場合や、他のテストが陰性の場合に特定の種を区別する必要がある場合に役立つ場合があります。

• 水酸化バリウム(Ba(OH) ₂ )の 10% 溶液を、一部のDiploschistes種に含まれる化学物質である Diploschistesic 酸でテストすると、紫色になります。
• 過酸化バリウム(BaO ₂ )の飽和溶液をオリベトール酸でテストすると、黄色に変わり、数分後には緑色に変わります。
• エタノール中の塩化第二鉄（FeCl ₃ ）の1％（重量/体積）溶液は、フェノール基を持つ化合物でテストすると、いくつかの色を生成する可能性があります。^[17]
• Nテストでは35%の硝酸溶液を使用し、メラネリア属の種とキサントパルメリア属の褐色種を区別するために使用できます。^[5]
• Sテストでは、アセトンで抽出した地衣類の乾燥サンプルに硫酸溶液（0.5%～10%）を塗り、炎で30秒間または発色するまで加熱します。紫色から明るいピンク色が持続する場合はミリキド酸の存在を示しており、面倒な化学分析に頼ることなく、形態的に類似した2種類の雪地衣類、Stereocaulon alpinumとS. groenlandicumを区別することができます。^[18]
• バイルシュタイン試験では、試験対象物質の小さなサンプルを銅線上で加熱します。ハロゲン化合物は一時的に深緑色の炎色を引き起こします。^[18]

スポットテストは、検査する地衣類の部分に少量の試薬を垂らして行う。多くの場合、地衣類の皮質と髄質の両方が検査されるが、時にはソラリアなどの他の構造を検査すると役に立つこともある。1つの方法は、少量の化学物質をガラスの毛細管に吸い上げ、地衣類の体細胞に接触させることである。この目的には小さな絵筆も使用される。反応は、手持ちの虫眼鏡または実体顕微鏡で最もよく見える。^{[8]皮質を取り除き、髄質にアクセスするには、}カミソリの刃が使用される。あるいは、ソラリア、偽性シフェラ、または鱗片の裏側など、皮質がないか髄質が露出している地衣類の特徴に溶液を塗布することもできる。 ^[19]

スウェーデンの化学者ヨハン・サンテッソンが提案したこの技術のバリエーションでは、ろ紙を使って色の反応をより簡単に観察できるようにしている。地衣類の断片をろ紙の上に押し付け、^{アセトン10}～20滴で地衣類の物質を抽出します。アセトンを蒸発させた後、地衣類の物質は地衣類の断片の周りの輪状にろ紙の上に残ります。その後、ろ紙を通常の方法でスポットテストすることができます。^[21]仮根でのスポットテストの結果が不確かな場合は、カバーガラスの下、最小限の水と試薬で組織の薄い切片を顕微鏡のスライド上で押しつぶすことができます。低倍率の顕微鏡対物レンズの下で、またはスライドを白い背景に置いたときに、色の変化が見えます。^{[8]この技術は、}ブリオリアなどの暗い色素を持つ地衣類をテストするときに役立ちます。^[5]

スポットテストは、単独でも組み合わせても使用できます。スポットテストの結果は通常、短いコードで表されます。このコードには、(1) 使用した試薬を示す文字、(2) 色の変化または色の変化がないことを示す「+」または「-」記号、(3) 観察された色を示す文字または単語が順に含まれています。さらに、地衣類のどの部分をテストしたかを示すように注意する必要があります。たとえば、「皮質 K+ オレンジ、C-、P-」は、試験片の皮質が KOH の適用でオレンジ色に変わり、漂白剤またはパラフェニレンジアミンでは変化しなかったことを意味します。同様に、「髄質 K-、KC+R」は、地衣類の髄質が KOH の適用に反応しないが、KOH の適用直後に漂白剤を適用すると髄質が赤くなったことを示します。^[12]

色の変化が現れるまでには、多少時間がかかることがあります。例えば、特定のクラドニア属では、フマルプロトセトラリン酸とのPD反応に30秒ほどかかることがあります。^[13]一方、CやKCとの反応は通常は一瞬で、試薬を塗布してから1秒以内に起こるため、色の変化を見逃しがちです。予想通りの結果が得られない理由はいくつか考えられます。原因としては、試薬が古くて化学的に不活性であることや、サンプル中の地衣類物質の濃度が低いことが挙げられます。仮根の色が濃い場合は、色の変化がわかりにくい可能性があり、ろ紙法などの他の手法の方が適しています。^[8]

スポットテストに加えて、他の診断手段を実行することが有用な場合もあります。たとえば、地衣類の代謝物の中には紫外線下で蛍光を発するものがあり、地衣類の特定の部分を紫外線源にさらすと、スポットテストと同様にそれらの代謝物の有無を明らかにすることができます。紫外線で明るい蛍光を発する地衣類物質の例としては、アレクトロニック酸、ロバリック酸、ジバリカティック酸、リヘキサントンなどがあります。場合によっては、紫外線テストを使用して、Cladonia deformation（UV−）とCladonia sulphurina（スクアマ酸の存在によりUV+）などの近縁種を区別することができます。^[19]地衣類を直接観察するには、長波長の紫外線のみが有用です。^[5]

薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、質量分析などのより高度な分析技術も、地衣類の化学組成を最初に特徴付ける場合や、スポットテストで何も明らかにならなかった場合に役立つ可能性があります。^[23]

フィンランドの地衣類学者ウィリアム・ニーランダーは、地衣類の識別を助ける化学物質の使用を初めて実証した人物であると一般に考えられています。^[24] 1866年に発表された論文で、彼は特徴的な色反応（通常は黄色、赤、緑）を得るためにKOHと漂白剤を使用したスポットテストを提案しました。^{[1] [25] [26]}これらの研究で、彼は例えば、現在Cetrelia cetrarioidesとC. olivetorumとして知られている地衣類は、後者ではC+赤であるのに対し、前者では反応しないという異なる色反応により、異なる種として区別できることを示しました。ニーランダーは、前者の種に含まれるパリエチンが強い色反応を引き起こすため、 KOHを使用して、よく似たXanthoria candelariaとCandelaria concolorを区別できることを示しました。彼はまた、地衣類の化学物質が皮質と髄質に均等に分布していないケースもあり、これらの領域で色の反応が異なることを知っていました。^[24] 1930年代半ば、朝比奈康彦はパラフェニレンジアミンを使ったテストを考案しました。これは、遊離アルデヒド基を持つ二次代謝物と黄色から赤色の反応を示します。^{[27] [28]このスポットテストは、後に}ミズゴケ科の分類学で特に有用であることが示されました。^{[29] [24]}

• 微結晶化

• アメージャン、ヴァーノン、ヘイル、メイソン E. (1973)。『地衣類』。ニューヨーク：アカデミック プレス。ISBN 978-0-12-044950-7。
• ダール、エイリフ;クロッグ、ヒルドゥル(1973)。デンマーク、フィンランド、ノルウェー、スウェーデンのマクロリケン。大学フォーラゲット。ISBN 9788200022626。
• Orange, A. ; James, PW ; White, FJ (2001)。地衣類の同定のための微量化学的方法。英国地衣類協会。ISBN 978-0-9540418-0-9。