Loading article…
一連の生化学的スイッチが、細胞周期のさまざまな段階間および段階内の遷移を制御します。細胞周期は、単一の細胞が2つの細胞に分裂する方法を制御する複雑で秩序だった一連の連続イベントであり、いくつかの異なる段階を含みます。段階には、G1期とG2期、DNA複製またはS期、および実際の細胞分裂プロセスである有糸分裂またはM期が含まれます。[ 1 ] M期では、染色体が分離し、細胞質分裂が起こります。
スイッチは細胞周期の秩序ある進行を維持し、次の段階に進む前に各段階が適切に完了したことを確認するチェックポイントとして機能します。[ 1 ]例えば、Cdk（サイクリン依存性キナーゼ）は細胞周期の主要な制御スイッチであり、タンパク質基質にリン酸を付加することで細胞がG1からS、またはG2からMへと移行することを可能にします。このような多成分（相互に連結した複数のタンパク質を含む）スイッチは、決定的で堅牢な（そして潜在的に不可逆的な）遷移を生成し、安定した振動を引き起こすことが示されています。[ 2 ]その結果、このような複雑な特性が生物学的制御システムにどのように組み込まれているかを理解しようとする活発な研究の対象となっています。[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]
多くの生物学的回路は、1つ以上のフィードバックループを利用して複雑な出力を生成します。生化学的イベントのシーケンスにおいて、フィードバックとは、シーケンスの下流要素（隣の画像のB）が上流要素（隣の画像のA）に影響を与え、将来的に自身の生成または活性化（出力）に影響を与えることを指します。この要素が自身の出力を増強するように作用する場合、それは正のフィードバック（青い矢印）に関与します。正のフィードバックループは自己強化ループとも呼ばれ、これらのループは、制御回路の特徴であるように、より大きなループの一部となる可能性があります。[ 1 ]
逆に、この要素が上流の要素を介して自身の抑制につながる場合、これは典型的な負のフィードバック（赤い鈍い矢印）です。負のフィードバックループはバランスループとも呼ばれ、遅延した負のフィードバック信号がシステムの恒常性バランスを維持するために使用される振動がよく見られます。[ 1 ]
フィードバックループは、増幅（正）または自己修正（負）に使用できます。正と負のフィードバックループの適切な組み合わせにより、超高感度と双安定性が生成され、[ 6 ] [ 7 ]、それが決定的な遷移と振動を生成する可能性があります。
正のフィードバックループと負のフィードバックループは、必ずしも明確に区別して機能するとは限りません。生化学的スイッチのメカニズムでは、これらは連携して柔軟なシステムを構築します。たとえば、Pfeuty & Kaneko (2009) によると、生化学システムの欠点を克服するために、正のフィードバック制御ループが負の制御ループと相互作用して安定状態からの脱出を促進する可能性があります。[ 8 ] 2 つの安定状態が共存することは双安定性として知られており、これは多くの場合、正のフィードバック制御の結果です。
複数の負のフィードバックループと正のフィードバックループの相互作用を示す例として、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ（Cdk）の活性化が挙げられます14。正のフィードバックループは、細胞のCdk活性を低レベルから高レベルへと切り替える役割を果たします。2種類のループ間の相互作用は、有糸分裂において顕著に現れます。正のフィードバックは有糸分裂を開始させますが、負のフィードバックループは、後期促進複合体によるサイクリン依存性キナーゼの不活性化を促進します。この例は、正と負のフィードバックループが細胞周期制御に及ぼす複合的な影響を明確に示しています。
刺激に対する「全か無か」の反応は、超高感度と呼ばれます。言い換えれば、刺激の非常に小さな変化が反応の非常に大きな変化を引き起こし、シグモイド型の用量反応曲線を描きます。超高感度反応は、ヒル係数nが1より大きい場合、ヒル方程式として知られる一般式V = S n /(S n + K m )で表されます。シグモイド曲線の傾きはnの値に依存します。n = 1の場合、双曲線型またはミカエリス型の反応が生じます。超高感度は様々なシステムで実現されており、注目すべき例として、酵素ヘモグロビンとその基質との協同的結合が挙げられます。超高感度反応はほぼ「デジタル」であるため、刺激に対する反応を増幅したり、（「オフ」状態と「オン」状態の間で）決定的な急激な遷移を引き起こしたりするために使用できます。
超高感度は細胞周期制御において大きな役割を果たしている。例えば、Cdk1とWee1は有糸分裂制御因子であり、阻害リン酸化によって互いに不活性化することができる。これは、両方の制御因子が互いに不活性化する二重負のフィードバックループを表している。Kimら（2007）によれば、双安定応答を生成するには超高感度要素が必要である。Wee1はCdk1に対して超高感度応答を示し、これはWee1上の様々なリン酸化部位間の基質競合によって生じると考えられる。[ 9 ]
双安定性はヒステリシスを意味し、ヒステリシスは多安定性を意味します。多安定性は、与えられた入力に対して2つ以上の安定状態が存在することを示します。したがって、双安定性は、システムが2つの定常状態に存在する能力です。[ 10 ]言い換えれば、応答が2つの定常状態値を持つことができる刺激値の範囲があります。双安定性にはヒステリシスが伴います。これは、システムが履歴に応じて2つの定常状態のいずれかに優先的に近づくことを意味します。双安定性にはフィードバックと超高感度回路要素が必要です。
適切な条件下では、正および負のフィードバックループによって双安定性の条件が提供されることがあります。たとえば、正のフィードバックを回路内の超高感度応答素子に結合させる場合などです。ヒステリシス双安定システムは、システムが「オン」状態と「オフ」状態の間を遷移するのがより困難であるため（同等の単安定超高感度応答と比較して）、堅牢な可逆スイッチとして機能します。また、システムは、一方の遷移が物理的に不可能になるように設定することもできます。たとえば、システムがすでに「オン」状態にある場合、刺激をどれだけ減らしても「オフ」状態に戻ることはありません。これにより、堅牢な不可逆スイッチが形成されます。単純な生物学的スイッチの設計方法については、会議論文に記載されています。[ 11 ]
ネットワークトポロジーと入力出力の間には一対一の対応関係はありません。なぜなら、多くのネットワークは入力と出力の関係が似ているからです。ネットワークトポロジーは入力や出力を意味するものではなく、同様に入力や出力もネットワークトポロジーを意味するものではありません。そのため、回路機能においてはパラメータ化が非常に重要になります。入力の動特性がシステムの応答と同程度かそれ以上に速い場合、応答はヒステリシスを示す可能性があります。
以下に、上述のメカニズムの一部を利用して、急激かつ／または不可逆的な遷移を実現する3つの細胞周期スイッチについて説明する。
G1 /S期移行は、出芽酵母ではスタートチェックポイント（他の生物では制限点）としてよく知られており、細胞周期の決定を制御します。 [ 1 ]このチェックポイントでは、細胞はDNA複製前に停止するか（栄養素の制限またはフェロモンシグナルによる）、G1期を延長するか（サイズ制御）、複製を開始して残りの細胞周期を進みます。出芽酵母のG1/S期制御ネットワークまたはレギュロンには、G1サイクリンCln1、Cln2、Cln3、Cdc28（Cdk1）、転写因子SBFおよびMBF、転写阻害因子Whi5が含まれます。[ 3 ] Cln3はCdk1と相互作用し、SBF、MBF、 Whi5を含む多数の標的をリン酸化することで一連のイベントを開始します。Whi5のリン酸化により、 Whi5は核外に移行し、SBFおよびMBFの阻害ができなくなります。活性型SBF/MBFは、B型サイクリンを活性化し、DNA複製、出芽形成、紡錘体複製を開始させることで、G1/S期移行を促進する。さらに、SBF/MBFはCln1とCln2の発現を促進し、これらはCdk1と相互作用して標的タンパク質のリン酸化を促進する。
このG1/Sスイッチは、当初Cln3から始まりS期で終わる一連の直線的なイベントとして機能すると考えられていました。[ 12 ]しかし、いずれか1つのClnがレギュロンを活性化するのに十分であるという観察結果は、Cln1とCln2が正のフィードバックを利用して自身の転写を活性化できる可能性を示唆しています。これにより、不可逆的な双安定トリガーとして機能する可能性のある、継続的に加速するサイクルが生じます。[ 2 ]スコータイムらは、出芽酵母の単一細胞測定を使用して、この正のフィードバックが実際に起こることを示しました。[ 3 ]少量のCln3がCln1/2の発現を誘導し、その後フィードバックループが引き継ぎ、Whi5が核から急激に出て、結果としてG1/Sレギュロン遺伝子の協調的な発現が起こります。協調的な遺伝子発現がない場合、細胞はG1期から抜けるのに時間がかかり、かなりの割合の細胞がS期前に停止することさえあり、G1/Sスイッチを鋭敏にする上で正のフィードバックが重要であることを示しています。
G1/S細胞周期チェックポイントは、真核細胞が最初のギャップ期であるG1期からDNA合成期であるS期へと移行するのを制御する。哺乳類細胞におけるこの切り替えには、CDK4/6-サイクリンDとCDK2-サイクリンEという2つの細胞周期キナーゼがチェックポイントの制御に関与している。[ 1 ] RbとE2Fを含む転写複合体は、このチェックポイントの制御において重要である。最初のギャップ期では、Rb-HDACリプレッサー複合体がE2F-DP1転写因子に結合し、下流の転写を阻害する。CDK4/6とCDK2によるRbのリン酸化は、Rbリプレッサー複合体を解離させ、細胞周期のオン/オフスイッチとして機能する。Rbがリン酸化されると、E2F転写活性に対する阻害が解除される。これにより、G1期からS期への切り替えを増幅するタンパク質をコードするS期遺伝子の転写が可能になる。
TGFβ、DNA損傷、接触阻害、複製老化、成長因子除去など、さまざまな刺激がチェックポイント制御を作動させる。最初の4つは、細胞周期キナーゼ阻害因子であるINK4またはKip/Cipファミリーのメンバーを誘導することによって作用する。TGFβは、細胞周期キナーゼを活性化するホスファターゼであるCdc25Aの転写を阻害し、成長因子除去はGSK3βを活性化し、サイクリンDをリン酸化する。これにより、サイクリンDの迅速なユビキチン化が起こる。[ 13 ]
G2期は、E2Fを介したサイクリンAの転写によって開始され、サイクリンA-Cdk2複合体が形成される。有糸分裂に進むためには、サイクリンB - Cdk1複合体（最初はMPFまたはM期促進因子として発見された。Cdk1は分裂酵母ではCdc2、出芽酵母ではCdc28としても知られている）がタンパク質ホスファターゼであるCdc25によって活性化される。[ 1 ]有糸分裂が始まると、核膜が崩壊し、染色体が凝縮して見えるようになり、細胞は分裂の準備をする。サイクリンB-Cdk1の活性化は核膜の崩壊をもたらし、これは有糸分裂開始の特徴である。[ 1 ]
サイクリン B-Cdk1 複合体は、Cdk1 がその活性化因子である Cdc25 をリン酸化して活性化し (正のフィードバック)、またその不活性化因子であるキナーゼWee1をリン酸化して不活性化する(二重の負のフィードバック)制御回路に関与している。 [ 1 ]この回路は、G2 期 (Cdk1 と Cdc25 がオフ、Wee1 がオン) と M 期 (Cdk1 と Cdc25 がアクティブ、Wee1 がオフ) の 1 つの安定定常状態を持つ双安定トリガーとして機能している可能性がある[ 14 ] 。ただし、Wee1 自体はCdr2などの他の因子によって制御されている。
1998年にヒトHeLa細胞株を用いた一連の実験で、細胞内のサイクリンBの空間的位置が有糸分裂を開始させるという説がJinら[ 15 ]によって提唱され、擁護された。ヒト細胞とヒトデ卵母細胞の両方で行われた以前の実験から、サイクリンB1は有糸分裂の非分裂期には細胞質に豊富に存在するが、細胞が有糸分裂に入る直前にCdk1と複合体を形成して核内で同定されることがJinらによってまとめられている。他の実験者は、サイクリンBが細胞質に残っていると細胞は分裂しないことを示した。細胞分裂と周期制御に対するサイクリンBの空間的位置の影響をさらに調査するために、JinらはサイクリンBに核局在シグナル（NLS）を付加し、サイクリンを核内に留めるようにした。当初、このNLSサイクリンBは、有糸分裂への移行を加速するという期待された効果を誘発しなかった。この結果は、下図に詳述されている阻害作用によるものです。サイクリンB-Cdk1複合体の阻害因子であるWee1は核内に局在し、おそらくNLSサイクリンBをリン酸化することで、予測どおりの機能を果たせなくしていると考えられます。この仮説は、JinらがCdk1のリン酸化されない変異体であるCdc2AFを用いて、サイクリンBの核内局在化により細胞分裂への移行が促進されることを観察した際に確認されました。したがって、サイクリンBの核内局在化は細胞分裂を誘発するために必要ではありますが、十分ではありません。
細胞周期制御の研究において、JinらはDNA損傷を受けた細胞におけるサイクリンBの局在を評価するために細胞を操作した。DNA損傷と外因性サイクリンBの核局在を組み合わせることで、サイクリンBが核内で強制的に発現されると、DNA損傷があっても細胞は分裂することが明らかになった。これは、サイクリンBの空間的局在が有糸分裂のチェックポイントとして機能している可能性を示唆している。細胞が通常、遺伝情報が損傷すると分裂しないが、内因性サイクリンBが核内で発現すると有糸分裂に入るのであれば、サイクリンBの細胞質への移行は未成熟な有糸分裂への移行を防ぐメカニズムであると考えられる。この仮説は、DNA損傷によりG2期で停止した細胞のJinらの解析によってさらに裏付けられた。これらの細胞において、Jinらは細胞質内で高レベルのサイクリンB-Cdc2複合体活性を観察した。これは、Cdc2が核への即時移行なしにサイクリンを活性化できることを示しているため、前述の理論を裏付ける証拠となる。さらに、DNA損傷により分裂していない細胞の細胞質にサイクリンB-Cdk1複合体が蓄積していることは、サイクリンBの核局在化が有糸分裂の開始を促すという理論を支持する。
結論として、サイクリンBの空間的局在は有糸分裂への移行に重要な役割を果たしている。サイクリンBの細胞質から核への移行は細胞分裂に必要であるが、それだけでは十分ではない。なぜなら、サイクリンBの阻害因子が存在すると、細胞は時期尚早に有糸分裂に移行できないからである。サイクリンB-Cdk1複合体のバックアップ阻害に加えて、サイクリンB自体の移行によっても時期尚早な細胞分裂は阻止される。DNA損傷のある細胞では、サイクリンB-Cdk1複合体は核へ移行せず細胞質に留まるため、細胞分裂への移行が阻害される。この分野の研究者が次に取り組むべき課題は、この移行がどのような特定のメカニズムによって制御されているかということである。
サントスら[ 16 ]は、サイクリンBの転座は、サイクリンB-Cdk1複合体の活性化を制御するのと同様の正のフィードバック機構によって制御されていると仮説を立てた。彼らは、正のフィードバックループにはサイクリンBのリン酸化と核への転座が関与していると考えていた。これを調査するために、彼らはまず、ジンらの実験結果の一部を再確認し、免疫蛍光法を用いて、分裂前に細胞質にサイクリンBが存在し、核へ転座して有糸分裂を開始することを示した。彼らはこれを核膜崩壊（NEB）と比較することで操作化した。Wee1やMyt1によって不活性化されない核サイクリンを用いて、サントスらは、活性核サイクリンが細胞質からより多くのサイクリンを核へ転座させることを観察した。彼らは、ラパマイシン処理（iRap）を用いてこの観察結果を確認した。 iRapは、タグ付きサイクリンBを細胞質から核へ移行させる。注目すべきことに、Santosらは、タグなしサイクリンBがiRapの影響を受けたサイクリンBと共に移動することを発見した。タグなしサイクリンは処理に感受性がなく、処理されたサイクリンとは独立して移動する。これは、有糸分裂開始につながるサイクリンBの核局在が、細胞質サイクリンBの核への移行を促進し、残りの細胞質サイクリンBの核への移行をさらに促進する、といった正のフィードバックループの最初の部分を裏付けている。
サントスらは、サイクリンBのリン酸化が正のフィードバックループのもう一つの構成要素であるとさらに仮説を立てた。彼らは、サイクリンBが核膜崩壊（NEB）前に自然に核内に入ることを観察した。対照的に、変異したリン酸化されないサイクリンBはNEB中に核内に入る。これは、細胞周期の特徴として、細胞周期の進行を有糸分裂へと誘導するために、サイクリンがNEB前に核内へ移行することであるため、予想外の結果である。したがって、サントスらは、サイクリンBのリン酸化が核内への移行を促進すると結論付けた。しかし、それに加えて、核内への移行はサイクリンのリン酸化を促進する。著者らは、核の全体的な体積が小さいため、リン酸化速度が速くなり、サイクリンBのリン酸化は細胞質よりも核内で19倍有利であると指摘している。リン酸化による転座の増加と転座によるリン酸化の増加は、以前に発見されたものと同様の正のフィードバックループを示しており、サイクリンB-Cdk1複合体を活性化する。
結論として、サイクリンBの核内局在は細胞分裂への移行に不可欠である。細胞分裂を可能にするサイクリンの細胞質から核への移行は、正のフィードバックループによって制御されている。活性型サイクリンBは核に移行し、核内に存在する他のサイクリンユニットの活性化と核内移行を促進する。この現象はリン酸化を考慮するとさらに顕著になる。サイクリンBのリン酸化は核への移行を促進し、核内のサイクリンBはリン酸化されやすいため、核内局在は逆にサイクリンBのリン酸化を促進する。
細胞が有糸分裂に入ると、サイクリン B-Cdk1 が後期促進複合体(APC) を活性化し、APC はサイクリン B を分解することでサイクリン B-Cdk1 を不活性化し、最終的に有糸分裂からの脱出につながります。双安定な Cdk1 応答関数を APC からの負のフィードバックと結合すると、緩和発振器として知られるものが生成され、[ 4 ] Cdk1 活性の急激なスパイクが強力な有糸分裂サイクルを引き起こします。しかし、緩和発振器では、制御パラメータはシステムの応答ダイナミクスに比べてゆっくりと動くため、有糸分裂の開始を正確に表しているかもしれませんが、必ずしも有糸分裂からの脱出を表しているとは限りません。
細胞周期の分裂期を終えるためには、サイクリンB-Cdk1複合体を不活性化する必要がある。その後、細胞は最初のギャップ期であるG1期に戻り、細胞周期が再び進行するまで待つことができる。
2003年、Pomereningらは、アフリカツメガエル卵母細胞の細胞質抽出物中のCdk1の活性化におけるヒステリシスと双安定性を実証することで、この仮説の強力な証拠を提供した。[ 4 ]彼らはまず、非破壊性サイクリンBの濃度変化に対するCdk1の不連続な急激な応答を実証した（Cdk1応答ネットワークをAPCを介した負のフィードバックから切り離すため）。しかし、このような応答は、単安定で超高感度な遷移と双安定な遷移の両方と一致する。これら2つの可能性を区別するために、彼らは、サイクリン濃度の変化に対する活性Cdk1の定常状態レベルを、2つの別々の実験で測定した。1つは間期抽出物から開始し、もう1つはすでに有糸分裂中の抽出物から開始した。サイクリンの中間濃度では、活性Cdk1の2つの定常状態濃度が見つかった。 2つの定常状態のどちらが占有されるかは、システムの履歴、つまり、間期抽出液から開始したか、分裂期抽出液から開始したかによって決まり、ヒステリシスと双安定性を効果的に実証した。
同年、Shaら[ 17 ]は、アフリカツメガエル卵抽出物を用いてヒステリシスループを明らかにし、独立して同じ結論に達した。本稿では、ヒステリシスが「有糸分裂への、そして有糸分裂からの細胞周期遷移」の原動力であると結論づけるために、 Novak-Tysonモデルの3つの予測を検証した。Novak-Tysonモデルの予測は、すべてのサドルノード分岐に共通するものである。サドルノード分岐は、不完全な世界において非常に有用な分岐であり、完全ではない生物システムの記述に役立つ。最初の予測は、有糸分裂に入るためのサイクリンの閾値濃度が、有糸分裂から抜け出すためのサイクリンの閾値濃度よりも高いというもので、これは、周期的な卵抽出物に分解されないサイクリンBを添加し、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（CHX）添加後の活性化および不活性化閾値を測定することによって確認された。[ 1 ]さらに、ノバック・タイソンモデルの 2 番目の予測も検証されました。複製されていないデオキシリボ核酸、つまり DNA は、有糸分裂に入るために必要なサイクリンの閾値濃度を上昇させます。この結論に至るために、細胞静止因子放出抽出物に CHX、APH (DNA ポリメラーゼ阻害剤)、またはその両方を添加し、分解されないサイクリン B を加えました。この論文でテストされ、正しいことが証明された 3 番目の最後の予測は、Cdc2 の活性化速度がサイクリンの活性化閾値濃度付近で遅くなるというものでした。これらの予測と実験は、動的システムにおけるヒステリシスによって説明できるトグルのようなスイッチング動作を示しています。[ 18 ]
中期から後期への移行では、姉妹染色分体が細胞の両端に適切かつ同時に分離されることが極めて重要である。[ 1 ]姉妹染色分体の分離は、分裂後期に時期尚早に分離するのを防ぐために最初は強く阻害されるが、姉妹染色分体の二方向配向が達成されると、後期促進複合体（APC）による阻害要素の破壊によってこの阻害は解除される。これらの阻害要素の1つはセキュリンであり、姉妹染色分体を結合している複合体であるコヒーシンの破壊を、コヒーシン複合体のサブユニットであるScc1を標的とするプロテアーゼであるセパラーゼに結合することによって防ぐ。このシステムでは、ホスファターゼCdc14がセキュリンから阻害リン酸を除去することができ、それによってAPCによるセキュリンの破壊が促進され、セパラーゼが放出される。 Uhlmann らによって示されたように、染色体が有糸分裂紡錘体に付着している間、姉妹染色分体間の凝集が分離を防ぐため、染色分体は対になったままです。[ 9 ] [ 19 ]凝集は DNA 複製中に確立され、Scc1、Scc3、Smc2、および Smc3 から構成される多サブユニット複合体であるコヒーシンに依存します。酵母では、中期から後期への移行時に、Scc1 が染色体から解離し、姉妹染色分体が分離します。この動作は、後期促進複合体によって破壊される後期阻害因子 Pds1 に強く結合している Esp1 タンパク質によって制御されます。Esp1 が Scc1 染色体結合の調節に役割を果たしていることを確認するために、細胞株をアルファ因子で G1 期で停止させました。これらの細胞は発生中停止状態のままでした。 Esp1-1変異細胞を用いて実験を繰り返したところ、Scc1は染色体に正常に結合し、合成終了後も結合状態を維持した。この結果は、Esp1が存在するとScc1がG1期に染色体と安定的に結合することが阻害され、Esp1が実際にScc1を染色体から直接除去できることを示す上で極めて重要であった。
Holt ら[ 5 ]は、セパラーゼが Cdc14 を活性化し、それが今度はセキュリンに作用して、中期から後期への移行の鋭さと姉妹染色分体分離の協調性を高める正のフィードバック ループを作り出すことを示した。[ 5 ] Holt らは、酵母の変異体「セキュリン」株を使用し、セキュリンのリン酸化調節の変化が姉妹染色分体分離の同期にどのように影響するかを調べることによって、セキュリン リン酸化における正のフィードバック効果の基礎を調べた。彼らの結果は、この正のセキュリン-セパラーゼ-cdc14 ループを妨害すると、姉妹染色分体分離の同期が低下することを示している。この正のフィードバックは、後期への移行に双安定性を生み出し、細胞が姉妹染色分体を分離するという不可逆的な決定を下す原因となる可能性がある。
有糸分裂からの離脱は、細胞にとって有糸分裂の終了と新しいG1 期の開始を示す重要な移行点であり、細胞は、有糸分裂から離脱したら、G1、S、G2 期を経て必要なチェックポイントをすべて通過するまで有糸分裂に戻らないように、特定の制御機構に頼る必要があります。サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)、ユビキチンリガーゼ、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤、可逆的リン酸化など多くの因子が有糸分裂からの離脱を制御し、細胞周期イベントが正しい順序でエラーが最小限になるようにします。[ 20 ]有糸分裂の終了は、紡錘体の崩壊、短縮した動原体微小管、および星状体 (非動原体) 微小管の顕著な伸長によって特徴付けられます。[ 21 ]通常の真核細胞では、有糸分裂からの離脱は不可逆です。[ 22 ]
真核生物モデル生物である出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、細胞が有糸分裂からの不可逆性を促進するために用いる制御機構に関して、多くの憶測がなされてきた。細胞周期調節因子のタンパク質分解と、それに伴うサイクリン依存性キナーゼのレベルへの影響が、真核細胞周期、特に中期から後期への移行を促進するメカニズムとして提案されている。この理論では、ユビキチンリガーゼの一種である後期促進複合体(APC) が、有糸分裂サイクリン (Clb2) および後期阻害因子 (PDS1、CUT2) の分解を促進して有糸分裂からの脱出を促進する。[ 23 ] APC は、有糸分裂サイクリンのNH2 末端ドメインにある破壊ボックス (D ボックス) として知られる 9 アミノ酸モチーフをユビキチン化し、プロテアソームによる分解を促す。[ 23 ] APCはCdc20と結合して（APC-Cdc20）、初期段階で有糸分裂サイクリン（Clb2）をユビキチン化して分解の標的とする。同時に、APC-Cdc20は、後期開始時に結合によって分離酵素を阻害するセキュリンの分解を媒介する。放出されて活性化した分離酵素は、姉妹染色分体を一緒に保持していたコヒーシンを切断し、姉妹染色分体の分離を促進し、核小体からのCdc14の放出を促進することによって有糸分裂からの脱出を開始する。[ 24 ] [ 25 ]後期段階では、Cdk1のダウンレギュレーションとCdh1活性化ホスファターゼであるCdc14の活性化により、Cdh1と結合したAPC（APC-Cdh1）の形成が促進され、Clb2が分解される。[ 22 ] APCの活性化因子であるCdc20とCdh1は、セキュリンやB型サイクリン(Clb)などの基質をリクルートしてユビキチン化します。[ 26 ] Cdk1-Clb2複合体がSli15、Ase1、 Ask1などの紡錘体ダイナミクスに関与するタンパク質をリン酸化しないと、紡錘体の伸長と染色体分離が促進され、有糸分裂からの脱出が促進されます。[ 22 ] 真核細胞周期におけるタンパク質分解の重要性により、細胞分裂は単純なキナーゼカスケードから、リン酸化、ユビキチン化、タンパク質分解間の相互作用が必要なより複雑なプロセスへと見方が変わりました。[ 23 ]しかし、INM-PP1（ATPアナログ）感受性Cdkアレルであるcdc28-as1を持つ出芽酵母細胞を用いた実験では、B型サイクリン（Clb）の破壊は不可逆的な有糸分裂からの脱出を誘発するために必要ではないことが証明された。[ 22 ]Clb2の分解は、不可逆的な有糸分裂からの離脱を誘発するために必要なCdk1阻害期間を短縮した。これは、サイクリンのタンパク質分解が、その作用のタイムスケールが遅いため、真核細胞周期の動的な性質に寄与しているが、不可逆的な細胞周期遷移を誘発する主要な決定要因である可能性は低いことを示している。[ 22 ]
真核細胞周期の調節において、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子のレベルが重要であることを示す発見がなされた。特に、出芽酵母のClb-CDK複合体の化学量論的阻害因子であるSic1のレベルは、S期キナーゼを不可逆的に活性化することにより、不可逆的なG1-S期移行において特に重要であることが示された。 [ 27 ] Sic1レベルは、G1-S期移行だけでなく、不可逆的な有糸分裂終結（M-G1期移行）の引き金となる主要な役割を果たすことが示された。有糸分裂中、Cdk1レベルの低下は、Cdh1およびSic1タンパク質の転写活性化因子であるSwi5の活性化を介してCdk1に対抗するホスファターゼであるCdc14の活性化につながる。[ 28 ] Sic1 がある一定の低レベルまで分解されると S 期の開始が引き起こされるが、不可逆的な有糸分裂からの脱出を誘発するには、Sic1 がある一定の高レベルまで蓄積する必要があった。[ 22 ] Cdk1 阻害剤は、分解されない Clbs またはプロテアソーム阻害剤の発現によって B 型サイクリンの分解が阻害された場合でも、有糸分裂からの脱出を誘導することができた。しかし、姉妹染色分体は分離せず、阻害剤が洗い流されると細胞は有糸分裂に戻った。これは、サイクリンの分解とは無関係に、不可逆的な有糸分裂からの脱出を誘発するには、阻害剤の閾値レベルに達する必要があることを示している。[ 29 ] G1-S 移行と比較して有糸分裂からの脱出を誘発するために必要な Sic1 レベルの閾値は異なるが、Sic1 レベルは CDK の活性を阻害することによって真核細胞周期の調節に重要な役割を果たすことが示された。
真核細胞の細胞周期にはさまざまなタンパク質と調節的相互作用が関わっているため、動的システムアプローチを採用することで、複雑な生物学的回路を一般的なフレームワークに単純化して、より優れた分析を行うことができます。[ 30 ] [ 31 ]可能な 4 つの入出力関係のうち、Sic1 レベルと有糸分裂終了の関係は、APC-Cdh1、Sic1、および Clb2-Cdk1 間のフィードバックによって駆動される不可逆的な双安定スイッチの特性を示しているようです。[ 22 ]双安定性は、細胞周期制御や細胞分化などの生物学的機能を制御することが知られており、多くの細胞制御ネットワークで重要な役割を果たしています。[ 32 ]双安定入出力関係は、2 つの分岐点を持つ 2 つの安定状態によって特徴付けられます。双安定領域では、1 つの特定の入力に対して複数の出力が可能であり、2 つの分岐点で示されます。さらに、双安定関係はヒステリシスを示します。システムが記憶を持っているため、最終的な状態/出力は入力の履歴と入力の現在の値に依存します。[ 30 ]一方の分岐点には負の制御パラメータ値があり（分岐点は軸の反対側にある）、その結果、2 つの安定状態が切断され、一方の状態から他方の状態への遷移が不可逆になります。有糸分裂の終了に関して、2 つの安定状態は有糸分裂と G1 期によって定義されます。Sic1 レベル（入力）が閾値を超えて蓄積すると、有糸分裂（安定状態 I）から G1 期（安定状態 II）への不可逆的な遷移が発生します。不完全な環境では、そのまま残る唯一の分岐はサドルノード分岐です。サドルノード分岐は崩壊しません（サドルノードは期待される一般的な挙動です）が、不完全性の存在下では、臨界横断分岐とピッチフォーク分岐は崩壊します。[ 33 ]したがって、不完全な生物学的世界で存在できる唯一の一次元分岐は、サドルノード分岐です。[ 30 ] M-G1遷移とSic1レベルの間の双安定関係は、制御パラメータであるSic1の量のわずかな変化によってシステムの挙動が質的に変化する2つのサドルノード分岐の図として表すことができる。
細胞周期の挙動はM-G1移行状態におけるSic1の量に大きく依存するため、Sic1の量はシステムレベルのフィードバックによって厳密に制御されている。Cdk1-Clb2はSic1をリン酸化してユビキチン化による分解に利用できるようにすることでSic1を阻害するため、APC-Cdh1依存的なCdk1-Clb2の分解は、利用可能なCdk1-Clb2複合体のレベルを低下させるだけでなく、Sic1のレベルを上昇させ、それがさらにCdk1-Clb2の機能を阻害する。[ 28 ]この二重負のフィードバックループの活性化は、APC-Cdc20依存的なCdk1-Clb2の分解と核小体タンパク質Net1/Cfi1からのCdc14の放出によって開始される。[ 34 ] FEAR (Cdc14 早期後期放出) 経路は、Net1 の Clb2-Cdk1 依存性リン酸化を促進し、Net1 から Cdc14 を一時的に放出します。[ 35 ]放出された Cdc14 と Clb2-Cdk1 複合体は紡錘体を形成し、有糸分裂出口ネットワーク (MEN) を活性化します。MEN は核小体からの Cdc14 の持続的な放出を可能にし、[ 35 ] Cdc14 は Cdh1 を活性化し、Sic1 転写活性化因子 Swi5 の活性化を介して Sic1 を安定化させることにより、Clb2-Cdk1 の活性に対抗します。[ 36 ] Sic1 は Cdk1-Clb2 を阻害して Swi5 の阻害を解除することで自身を正に制御し、Cdh1 もまた Clb2-Cdk1 を阻害して MEN の阻害を解除することで自身を正に制御し、MEN は Cdc14 を活性化し、続いて Cdh1 自身を活性化する。APC-Cdh1 と Sic1 によって形成される二重負のフィードバック ループは、Clb2 が転写因子 Fkh2– Mcm1 Ndd1 複合体を活性化することで合成を自己活性化するため、Clb2-Cdk1 の活性を低く維持するために必要である。[ 28 ]
真核細胞の細胞周期は、細胞分裂が正確かつ成功裏に行われることを保証するためのさまざまなチェックポイントとフィードバックループで構成されています。たとえば、有糸分裂中に、複製された染色体が有糸分裂紡錘体に不適切に付着すると、 Mad や Bub などの紡錘体アセンブリチェックポイント(SAC) タンパク質が APC-Cdc20 を阻害して、後期への移行と B 型サイクリンの分解を遅らせます。さらに、有糸分裂紡錘体がミスアライメントされると、Bub2 および Bfa1 依存的に MEN およびそれに続く Cdc14 が阻害され、有糸分裂サイクリンの分解と後期への移行が防止されます。[ 36 ] Sic1 は、システムレベルのフィードバックがどのように相互作用して環境条件を感知し、細胞周期の遷移を引き起こすかを示す良い例です。実際の M-G1 移行は多数のタンパク質と制御が関与する非常に複雑なものですが、動的システムアプローチにより、この複雑なシステムを、出力 (有糸分裂からの脱出) が Sic1 の臨界濃度に依存する 2 つのサドルノード分岐を持つ双安定入力/出力関係に単純化することができます。一次元解析を使用すると、システムレベルの制御とフィードバックによって制御される真核細胞周期の多くの不可逆的な移行点を説明できる可能性があります。不可逆的な移行点の他の例としては、スタート (新しい細胞分裂周期への不可逆的なコミットメント) があり、これは、制御パラメータが Cln2、Whi5、およびSBF を含むシステムフィードバックによって厳密に制御される不可逆的な双安定スイッチによって説明できます。[ 37 ]