シック1

タンパク質であるSic1は、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるCdk1 -Clb（B型サイクリン）複合体の化学量論的阻害剤^[1]です。B型サイクリン-Cdk1複合体はS期開始の駆動因子であるため、Sic1は未熟なS期への移行を防ぎます。^[2] Sic1の 多部位リン酸化は、Sic1のユビキチン化と破壊のタイミングを決定し、ひいてはS期移行のタイミングを決定すると考えられています。^[3]

細胞周期のG1期では、Sic1はCdc28-Clb複合体に強く結合し、それを阻害します。^{[4] Cdc28-Clb活性が低いと、酵母では}有糸分裂紡錘体の分解、複製前複合体の組み立て、および芽形成の開始につながります。

酵母細胞周期の開始時点で、G1サイクリン Cln3、Cln1、Cln2がCdc28を活性化します。活性化された複合体は複数の部位でSic1をリン酸化するため、SCF複合体による分解が起こります。^[5] Sic1が分解されると、Cdc28-Clb複合体は阻害されなくなり、細胞はS/M期に入ることができます。したがって、Sic1の不活性化はS期への移行に不可欠です（図1）。

Cdc28 は B 型サイクリン(Cdc28-Clb)と複合体を形成し、 Sic1 の転写因子であるSwi5 をリン酸化します。これにより、Swi5 の核から細胞質への輸出が促進され、cdk 阻害剤のさらなる転写が回避されます。Cdc28-Clb はまた、Cdc28-Cln とまったく同じように、まだ存在する Sic1 分子をリン酸化して、ユビキチン依存性分解を引き起こします。 ^[4] Cdc28-Clb レベルが高いと、DNA 複製および紡錘体極体 (SPB) の複製も開始されます。次に、中期紡錘体が組み立てられ、染色体の分離が起こります。Sic1 の転写は、Swi5 によって媒介されて、終期に開始されます。Aca2 は Sic1 の別の転写因子ですが、G1 まで不活性のままです。^[6]有糸分裂の終わりに、Sic1 は Cdc28-Clb の不活性化に関与します。^[7]

SCF複合体のCdc4に認識されるためには、Sic1は、多くの場合サイクリン-Cdk複合体によって、9つのcdk部位のうち少なくとも6つでリン酸化される必要がある（図2）。 ^[8] Sic1は、Cln1とCln2が存在しない場合に必須となるキナーゼであるPho85-Pc11など、他のキナーゼによってもリン酸化される可能性がある。^[9] Sic1は、浸透圧ストレスへの応答にも関与している。ストレス活性化タンパク質キナーゼ（SAPK）Hog1は、カルボキシル末端の1つの残基でSic1をリン酸化します。これにより、サイクリン発現のダウンレギュレーションとSic1の安定化が起こり、細胞周期が停止する。^[10]

Sic1は、ユビキチン化による分解のためには複数の部位でリン酸化される必要がある（図2）。Sic1がCdc4によってSCF複合体にリクルートされるためには、複数のリン酸化が必要である。^[11] Cdc4基質認識機構には、折り畳まれてリン酸化されているSic1の表面にあるコンセンサス結合モチーフ、いわゆるCdc4ホスホデグロン（CPD）との相互作用が含まれる。Cdc4の最適なコンセンサス配列は、リン酸化セリンまたはスレオニンに続いてプロリンと塩基性アミノ酸であることがわかっている。しかし、Sic1表面のCPDのどれもがそのような構成を示していない。したがって、Cdc4への高親和性結合を得るには、Sic1の複数のリン酸化が必要である。^[8]この機構は非効率的に見えるが、環境中のCln/cdc28濃度を測定できるため、細胞にとっては利点がある。リン酸化部位の数はCln/cdc28の濃度に対応しており、Sic1はこのタンパク質のセンサーとして考えることができます。超高感度キナーゼカスケードフィードバックループの多くの急激な遷移とは対照的に、このメカニズムは微調整された制御を可能にします。^[8]さらに、複数のリン酸化が必要なため、Sic1がランダムに分解される確率は小さいです。Sic1の複数のリン酸化を利用して、細胞は遺伝的安定性を提供するために絶対に不可欠なDNA複製の開始を高度に制御する戦略を進化させました。

Sic1 分解の制御を簡略化すると、複数の CDK 部位のリン酸化が関与する。これらの部位は、最適および最適でないコンセンサスリン酸化モチーフから構成される。Koivomagi らによる最近の研究では、サイクリン-CDK 複合体と Sic1 タンパク質間の多重リン酸化反応の多くの複雑さが明らかになった。これらの研究は、プライミング部位、結合部位、デグロン ペア、リン酸化部位の距離、および相対的な部位位置を含む、Sic1 CDK リン酸化部位の重要な特性を明らかにした。さらに、これらの研究では、Cks1 リン酸化結合ポケット、サイクリン ドッキング モチーフ、およびCdk1活性部位の特異性など、Sic1 リン酸化に対する他の要因の影響も強調されている。これらのメカニズムはすべて、Sic1 分解およびS 期の開始につながる一連のイベントのダイナミクスに寄与している。^{[12] [13]}

Cks1 は、Cdk1 サイクリン複合体の見過ごされがちな構成要素であるだけでなく、Sic1 の多重リン酸化と分解にも重要です。Cks1 のリン酸化結合ポケットは、Sic1 上のリン酸化 CDK 部位に独立して結合できます。さらに、Cks1 のホスホセリンに対する結合親和性は非常に弱いため、Cks1 の結合は基本的にホスホトレオニンの存在のみに依存します。したがって、Cdk1 リン酸化部位が 1 つまたはホスホセリンのみが存在する Sic1 変異体では、Cks1 は基質に適切に結合できず、Sic1 の多重リン酸化を促進できません。これは、ランダムな分配リン酸化モデルの以前の理論ではなく、プロセッシブリン酸化メカニズムを支持する強力な根拠となります。^[8]スレオニンを必要とすることに加えて、Cks1 の Sic1 への結合は、スレオニン残基に対して -2 の位置にプロリン残基を導入することで強化できます。^{[12] [13]}

Sic1は不規則領域を持つ分子であり、リン酸化部位の距離を操作するのに役立ちます。以下の発見のために、Koivomagiらは、主要なリン酸化部位として機能するT33最適コンセンサスモチーフと、二次部位として機能する準最適モチーフを持つSic1コンストラクトを利用しました。^{[12] [13]}

観察を二重リン酸化 Sic1 構造物に限定すると、2 段階のリン酸化プロセスが観察され、最初の段階は一次部位のリン酸化でした。しかし、リン酸化が起こるためには、二次部位が一次部位に対してタンパク質の C 末端側に位置している必要があります。二次部位のリン酸化も位置の影響を受けます。ピークのリン酸化率は +12 から +16 アミノ酸距離の間に見られ、+10 から +12 の範囲で顕著に増加し、+20 から +30 の範囲では徐々に減少しました。-2 プロリン残基の導入により、ピークのリン酸化範囲が拡大してin vitro でのリン酸化が促進されますが、+10 未満の距離ではリン酸化活性は増加しません。このピークのリン酸化範囲の拡大は、プライミング部位と Cks1 の結合が強化されたためである可能性があります。^{[12] [13]}

5つのリン酸化残基（1つのプライミング部位と2つのホスホデグロンペア）を含む単純なSic1コンストラクトは、プライミング部位のわずかな動きが細胞周期の進行に大きな影響を与える可能性があることを明らかにしました。リン酸化を最大化するには、プライミング部位はホスホデグロンペアの両方の残基の+12から+16の範囲内にある必要があります。^{[12] [13]}

Sic1 リン酸化は G1 サイクリン Cln1,2 によって開始され、その後 S 期サイクリンClb5,6によって完了します(図 1)。サイクリンのドッキング モチーフは Sic1 リン酸化ダイナミクスに関与しています。S 期サイクリンは RXL ドッキングを使用し、G1 サイクリンは LLPP ドッキングを使用します。Sic1 リン酸化は、Clb5 の RXL モチーフが最適な CDK モチーフに対して +16 から +20 の位置にあるときに増加します。モチーフの N 末端に位置する RXL 配置では、リン酸化の量は無視できます。対照的に、LLPP モチーフをプライミング サイトから遠ざけると、方向性に関係なく Cln2 リン酸化が増加します。^{[12] [13]}

Cks1 依存性の多重リン酸化は、プロセッシブまたはセミプロセッシブな方法で発生し、これは正常細胞に中間の Sic1 リン酸化状態が存在しないことから明らかです。このプロセッシビティは、サイクリン ドッキング サイトの存在にも依存します。この部位の変異数が増加すると、正味のリン酸化速度が低下するためです。プロセッシブ リン酸化には、単一の結合イベントが 2 つ以上の部位のリン酸化につながる 2 つのメカニズムが考えられます。最初のメカニズムでは、酵素複合体から解離することなく、主要部位がリン酸化され、すぐに活性部位から Cks1 結合ポケットに移動して、他の CDK 部位の追加のリン酸化が可能になると考えられています。2 番目のメカニズムでは、リン酸化された主要部位が別の場所に結合して継続的に結合し、他の CDK 部位が多重リン酸化のために順次活性部位に結合すると考えられています。シミュレーションによれば、解離を伴わない最初のリン酸化イベントの後の2回目のリン酸化イベントの確率は、第1および第2のメカニズムでそれぞれ40％および20～40％であると予測されています。^{[12] [13]}

Sic1 はSCF (Cdc4) によって分解の標的とされ、Sic1 ホスホデグロン ペアを認識します。これらのホスホデグロン ペアは、それぞれ Cdc4 に強い親和性を持つ、近接して位置するペアになったリン酸化残基です。S69/S76/S80 クラスターを持つ Sic1 構築物では、これらのホスホデグロン ペアの連続リン酸化は Cdk1 サイトに依存します。Clb5 の連続性は T5 および T33 サイトに依存し、Cln2 の連続性は T5 に依存します。さまざまな残基の再導入により、T45/T48 ホスホデグロン ペアのドッキング サイトとして機能する T33 残基が発見されました。この残基は、他のホスホデグロン ペアが存在しない場合に、ある程度 Sic1 分解を促進することができます。^{[12] [13]}

以下は、Koivomagi らによって提案された、Sic1 のリン酸化と分解を促進する 生体内カスケードのメカニズムです。

G1 後期では、Sic1 は Clb5-Cdk1 複合体を阻害し、同時に自身の分解を阻害します。リン酸化カスケードは、T5 プライミング部位の Cln2-Cdk1 リン酸化によって進行します。これに続いて、T33、T45、および S76 残基が Cln2-Cdk1 によってリン酸化されますが、デグロン ペアはリン酸化されません。しかし、これらのリン酸化部位は Clb5-Cdk1 ドッキングを促進し、最適でない部位での Sic1 リン酸化の増加と、Sic1 分解が増加する一方で Clb5-Cdk1 阻害が継続的に減少するという正のフィードバック ループにつながります。^{[12] [13]}

p27Kip1タンパク質はSic1のヒト相同体であり、両方とも保存された阻害ドメインを持っていますが^[14]、p27Kip1はG1サイクリンを阻害しますが、サイクリンBは阻害しません。

p27Kip1 およびその他のサイクリンキナーゼ阻害剤に関連するヒト疾患がいくつかあります。

• 甲状腺のすべての乳頭状微小癌（PMC）は、正常な甲状腺組織よりもp27Kip1の発現が低い。さらに、より悪性度が高く転移しやすい乳頭状微小癌におけるp27Kip1の発現は、転移しない微小癌と比較して大幅に低下している。これらの結果は、p27Kip1が腫瘍抑制因子として作用することを示唆している。^[15]
• カポジ肉腫は、エイズと併発して発症する癌の一種で、ヒトヘルペスウイルス8（HHV8）が原因と考えられています。このウイルスは、Cdk6と複合体を形成するウイルスサイクリンを発現します。このKSHV-サイクリン-Cdk6複合体はp27Kip1をリン酸化して不安定化し、その結果p27Kip1のレベルが低下します。これは、p27Kip1の劣化が腫瘍の発達に関連していることを示唆しています。^[16]
• 胃腺癌（胃がん）の患者は、腫瘍のp27Kip1発現が高い場合、生存率が高くなります。p27Kip1発現が低いと、腫瘍の脱分化、胃壁への浸透の増加、リンパ節転移、腫瘍ステージの進行につながる可能性があります。^[17]

したがって、ヒト Cdk 阻害剤p27Kip1は潜在的な腫瘍抑制タンパク質です。その発現が減少すると、G1 期から S 期への無秩序な進行が起こり、細胞分裂が制御不能になり、腫瘍の形成が促進される可能性があります。

• p27
• CDKN1B

• yeastgenome.org の Sic1 のページ