二光子励起顕微鏡

2光子励起顕微鏡法（TPEFまたは2PEF）は、厚さ約1ミリメートルまでの散乱生体組織の画像化に特に適した蛍光画像化技術です。励起波長が発光波長より短い従来の蛍光顕微鏡法とは異なり、 2光子励起では、発光よりも長い波長を持つ2つの光子による同時励起が必要です。レーザーは組織内の特定の場所に焦点を合わせ、サンプル全体をスキャンして画像を順次生成します。2光子励起の非線形性により、主にレーザービームのマイクロメートルサイズの焦点にある蛍光体が励起され、画像の空間分解能が得られます。これは、励起焦点とピンホールによる限定された検出の相互作用によって空間分解能が生成される 共焦点顕微鏡法とは対照的です。

2光子励起顕微鏡法では、通常、蛍光色素を励起することもできる近赤外（NIR）励起光を使用します。赤外光は一般的な生物組織内で散乱が少ないため、赤外光を使用すると組織内での散乱が最小限に抑えられます。多光子吸収により、バックグラウンド信号は大幅に抑制されます。両方の効果により、この技術の浸透深度が増加します。2光子励起は、組織への浸透が深く、光検出が効率的で、光退色が低減されるため、共焦点顕微鏡法の優れた代替手段となります。^{[1] [2]}

2光子励起は2光子吸収を利用します。この概念は、マリア・ゲッパート・マイヤー（1906–1972）が1931年に博士論文で初めて説明し、^{[3] 1961年に}ヴォルフガング・カイザーがレーザー励起を用いてCaF ₂ :Eu ²⁺結晶で初めて観察しました。^[4]アイザック・アベラは1962年にセシウム蒸気中で単一原子の2光子励起が可能であることを示しました。^[5]

2 光子励起蛍光顕微鏡法は、レーザー走査型共焦点顕微鏡法やラマン顕微鏡法などの他の共焦点レーザー顕微鏡法と類似しています。これらの技術は、ラスター パターンで走査される集束レーザー ビームを使用して画像を生成するもので、どちらも光学セクショニング効果があります。共焦点顕微鏡とは異なり、多光子顕微鏡には、共焦点顕微鏡に光学セクショニング品質を与えるピンホール開口部がありません。多光子顕微鏡によって生成される光学セクショニングは、励起の点像分布関数の結果です。2 光子励起の概念は、1 光子励起に必要な光子エネルギーよりも比較的低い光子エネルギーを持つ 2 つの光子でも、 1 つの量子イベントで蛍光体を励起できるという考えに基づいています。各光子は、分子を励起するために必要なエネルギーの約半分を持っています。放出された光子は、2 つの励起光子のどちらよりも高いエネルギー (短い波長) です。2 つの光子がほぼ同時に吸収される確率は極めて低いです。したがって、通常はフェムト秒パルスレーザーによって生成される励起光子の高ピークフラックスが必要になります。たとえば、同じ平均レーザー出力でもパルスがなければ、2光子効果を介してパルスレーザーによって生成される蛍光と比較して、検出可能な蛍光は発生しません。多光子顕微鏡のより長い波長、より低いエネルギー（通常は赤外線）の励起レーザーは、単一光子励起に通常使用される短波長レーザーよりも損傷が少なく、生体組織をより少ない毒性効果でより長い期間観察できるため、生細胞の画像化に適しています。

最も一般的に使用される蛍光体は 400～500 nm の範囲に励起スペクトルを持つのに対し、2 光子蛍光を励起するために使用されるレーザーは、Ti-サファイア レーザーによって生成される約 700～1100 nm (赤外線) の範囲にあります。蛍光体が 2 つの赤外線光子を同時に吸収すると、励起状態に上昇するのに十分なエネルギーを吸収します。次に、蛍光体は、使用される蛍光体の種類に応じた波長 (通常は可視スペクトル) を持つ単一の光子を放出します。蛍光体の励起中に 2 つの光子が吸収されるため、蛍光体からの蛍光放出の確率は励起強度の 2 乗で増加します。したがって、レーザー ビームが拡散している場所よりも、レーザー ビームがしっかりと焦点を合わせている場所では、はるかに多くの 2 光子蛍光が生成されます。実質的に、励起は小さな焦点体積 (約 1 フェムトリットル) に制限されるため、焦点が合っていない物体が高度に排除されます。この励起の局在化は、ピンホールなどの要素を使用して焦点外の蛍光を排除する必要がある単一光子励起顕微鏡と比較した場合の重要な利点です。サンプルからの蛍光は、光電子増倍管などの高感度検出器によって収集されます。この観測された光の強度が最終的な画像の 1 つのピクセルになります。焦点はサンプルの必要な領域全体でスキャンされ、画像のすべてのピクセルを形成します。

2光子顕微鏡法は、 1990年にコーネル大学のワット・W・ウェッブ研究室でウィンフリード・デンクとジェームズ・ストリックラーによって開発され、特許を取得しました。彼らは、 2光子吸収のアイデアとレーザースキャナーの使用を組み合わせました。 ^{[1] [6]} 2光子励起顕微鏡法では、赤外線レーザービームが対物レンズを通して焦点を合わせられます。通常使用されるチタンサファイアレーザーは、パルス幅が約100フェムト秒（fs）、繰り返し率が約80MHzであるため、2光子吸収に必要な高い光子密度と光束が得られ、広範囲の波長にわたって調整可能です。

光散乱組織中の蛍光体を励起するために赤外線を使用すると、さらなる利点がある。^[7]長い波長は短い波長よりも散乱の程度が低いため、高解像度の画像化に有利である。さらに、これらの低エネルギー光子は焦点体積の外側に損傷を与える可能性が低い。共焦点顕微鏡と比較すると、散乱光子でさえも使用可能な信号に寄与するため、光子検出ははるかに効果的である。散乱組織の画像化におけるこれらの利点は、2光子励起顕微鏡が発明されてから数年後に初めて認識された。^[8]

2 光子顕微鏡の使用には、いくつかの注意点があります。2 光子励起に必要なパルス レーザーは、共焦点顕微鏡で使用される連続波 (CW) レーザーよりもはるかに高価です。分子の 2 光子吸収スペクトルは、1 光子吸収スペクトルとは大幅に異なる場合があります。高次の光損傷が問題となり、退色はレーザー出力の 2 乗に比例しますが、単一光子 (共焦点) の場合は線形です。孤立した細胞などの非常に薄い対象物の場合、単一光子 (共焦点) 顕微鏡は励起波長が短いため、より高い光学解像度の画像を作成できます。一方、散乱組織では、2 光子顕微鏡の優れた光学セクショニング機能と光検出機能により、より優れたパフォーマンスが得られます。

二光子顕微鏡法は、生理学、神経生物学、発生学、組織工学など、数多くの分野で利用されてきました。この技術により、薄くほぼ透明な組織（皮膚細胞など）でさえも、鮮明な詳細で視覚化されています。^[9]二光子顕微鏡法の高速イメージング機能は、非侵襲性光生検にも活用できます。^[10]二光子顕微鏡法は、局所的な化学反応を生み出すために適切に使用されており、^[8]その効果は、二光子ベースのリソグラフィーにも使用されています。二光子蛍光と第二高調波発生に基づく顕微鏡法を使用して、有機ポルフィリン型分子は、二光子蛍光と第二高調波発生に対して異なる遷移双極子モーメントを持つことができることが示されました。 ^[11]これらは、そうでなければ同じ遷移双極子モーメントから発生すると考えられていました。^[12]非変性二光子励起、つまり波長の異なる2つの光子を使用すると、テストしたすべての小分子と蛍光タンパク質の蛍光が増加することが示されました。^[13]

2PEFは皮膚がんの特性評価にも非常に有用であることが証明されており^[14]、さらに体外での乳がんのモニタリングにも有用であることが証明されている^{[15] [16]} 。また、腫瘍細胞の停止、腫瘍細胞と血小板の相互作用、腫瘍細胞と白血球の相互作用、転移性コロニー形成プロセスを明らかにすることも示されている^{[17] 。}

2PEFは、哺乳類の胚の長期生細胞イメージングに関しては共焦点顕微鏡などの他の技術よりも有利であることが示されている。 ^[18]

2PEFは、特に腎臓細胞に関して、アクセスが困難な細胞タイプの可視化にも使用されています。^[19]流体力学と濾過をよりよく理解するために使用されています。^[20]

2PEFは、2P活性Ca2+感受性染料を用いた細胞培養におけるウイルス（SARS-CoV-2）感染^の相関をモニタリングするための貴重なツールであることも証明されました。^[21]

2PEFおよびこの方法の3PEFへの拡張は、生きている動物や行動中の動物の脳内の完全な神経組織を特徴付けるために使用されます。特に、この方法は、ニューロンまたはニューロン集団のカルシウムイメージングに有利であり、 ^[22]グルタミン酸などの成分の局所的なアンケージングを含む光薬理学^[23]または光スイッチ薬物の異性化^{[24] [25]}、および神経伝達物質の濃度を報告する他の遺伝子コード化センサーのイメージングに有利です。^[26]

現在、二光子顕微鏡は、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ラット、鳴禽類、霊長類、フェレット、マウス（Mus musculus）、ゼブラフィッシュなどのモデル生物のニューロンのライブ発火を画像化するために広く使用されています。^{[27] [28] [29]}顕微鏡とスキャン装置のサイズのため、動物は通常頭部を固定されていますが、動いたり自由に行動したりする動物のニューロンを画像化できる小型顕微鏡も開発されています。^{[30] [31]}

3つ以上の光子を同時に吸収することも可能であり、より高次の多光子励起顕微鏡法が可能となる。^[32]いわゆる「3光子励起蛍光顕微鏡法」（3PEF）は、2PEFに次いで最もよく使用される技術であり、2PEFを補完するものである。3光子励起を用いた生体内での光スイッチ性薬物の局所異性化も報告されている。 ^[33]

一般的に、一般的に使用される蛍光タンパク質（CFP、GFP、YFP、RFP）と色素はすべて、2 光子モードで励起できます。2 光子励起スペクトルは多くの場合かなり広く、励起波長を切り替えることで蛍光体を選択的に励起することが難しくなります。^{[引用が必要]}

極めて高い2光子吸収断面積を持つ、緑色、赤色、近赤外発光色素（プローブおよび反応性ラベル）がいくつか報告されている。^[34]ドナー-アクセプター-ドナー型構造のため、Seta-670、Seta-700、Seta-660などのスクアライン色素は、他の色素と比較して非常に高い2光子吸収（2PA）効率を示す。^{[34] [35] [36]}新しいタイプのスクアラインロタキサンであるSeTau-647とSeTau-665は、近赤外領域で最大10,000 GMという極めて高い2光子作用断面積を示し、他のどのクラスの有機色素よりも優れている。^[34]

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• 二光子光電子分光法
• 広視野多光子顕微鏡

• シュミット、マイケル。マイヤーヘーファー、トーマス;ポップ、ユルゲン。クレッペ、インゴ。ヴァイシャート、クラウス (2013)。 「光と物質の相互作用」。バイオフォトニクスのハンドブック。土井：10.1002/9783527643981.bphot003。ISBN 978-3-527-64398-1. S2CID  93908151。
• König, Karsten (2018).多光子顕微鏡法と蛍光寿命イメージング：生物学と医学への応用。Walter de Gruyter GmbH & Co KG. ISBN 978-3-11-042998-5。
• アディブ州ケイコスラヴィ。ブレッドフェルト、ジェレミー S.サーガル、アブドゥル・カデル。エリシリ、ケビン W. (2014)。 「がんの第二高調波イメージング」。細胞生物学における定量的イメージング。細胞生物学の方法。 Vol. 123. 531–546 ページ。土井：10.1016/B978-0-12-420138-5.00028-8。ISBN 978-0-12-420138-5. PMID  24974046。
• Yu, Hanry; Rahim, Nur Aida Abdul (2013)。細胞および組織工学におけるイメージング。CRC Press。ISBN 978-1-4398-4804-3。

• 2光子顕微鏡の簡素化
• ウェビナー: シンプルでコスト効率の高い 2 光子顕微鏡のセットアップ
• 2光子に適した染料
• 多光子顕微鏡の紹介
• レーザー走査顕微鏡による複数のリアルタイム画像の取得（サンダーソン顕微鏡記事）
• ビデオレートの 2 光子顕微鏡を自分で作る
• 二光子蛍光顕微鏡、生命科学百科事典
• 「多光子蛍光顕微鏡法」。顕微鏡入門。フロリダ州立大学。 2018年3月3日閲覧。
• 多光子励起蛍光顕微鏡。ウィスコンシン大学。
• 多光子励起顕微鏡の基礎と応用。Nikon MicroscopyU。
• 「2光子作用断面積」。
• 「2光子吸収（2PA）スペクトルデータベース」。KBFI。