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ツーハイブリッドスクリーニング（元々は酵母ツーハイブリッドシステムまたはY2Hとして知られていた）は、2つのタンパク質間または1つのタンパク質とDNA分子間の物理的相互作用（結合など）をテストすることにより、タンパク質間相互作用（PPI）[ 1 ]およびタンパク質-DNA相互作用[ 2 ] [ 3 ]を発見するために使用される分子生物学的手法です。
このテストの前提は、転写因子が上流の活性化配列（UAS）に結合することによって下流のレポーター遺伝子が活性化されるというものです。ツーハイブリッドスクリーニングでは、転写因子はDNA結合ドメイン（DBD、またはBDと略されることが多い）と活性化ドメイン（AD）と呼ばれる2つの別々の断片に分割されます。BDはUASへの結合を担うドメインであり、ADは転写の活性化を担うドメインです。[ 1 ] [ 2 ]したがって、Y2Hはタンパク質断片の相補性アッセイです。
1989年にスタンレー・フィールズとオクキュ・ソンによって開拓されたこの技術は、もともと酵母Saccharomyces cerevisiaeのGal4転写活性化因子を用いてタンパク質間相互作用を検出するために設計されたものでした。Gal4タンパク質はガラクトース利用に関わる遺伝子の転写を活性化し、これが選択の基礎となりました。[ 4 ]それ以来、同じ原理が応用され、タンパク質-DNA相互作用やDNA-DNA相互作用を検出する方法、酵母の代わりに大腸菌や哺乳類細胞などの異なる宿主生物を使用する方法など、多くの代替方法が開発されました。[ 3 ] [ 5 ]
ツーハイブリッドスクリーニングの鍵は、ほとんどの真核生物転写因子において、活性化ドメインと結合ドメインがモジュール式であり、直接結合することなく互いに近接して機能できることである。[ 6 ]これは、転写因子が2つの断片に分割されていても、2つの断片が間接的に連結されていれば転写を活性化できることを意味する。
最も一般的なスクリーニング方法は、酵母ツーハイブリッド法です。この方法では、研究者は使用する培地（寒天プレート）上の各プレイの位置を把握しています。過去 10 年間で、 ハイスループットスクリーニングシステム（多くの場合ロボットを使用）を使用して、いくつかの生物における何百万もの潜在的な相互作用がスクリーニングされ、数千を超える相互作用が検出され、BioGRIDなどのデータベースに分類されています。[ 7 ] [ 8 ]このシステムでは、特定の栄養素（通常はアミノ酸または核酸）の生合成が欠如している遺伝子操作された酵母株がよく使用されます。これらの栄養素が欠如した培地で培養すると、酵母は生存できません。この変異酵母株は、プラスミドの形で外来 DNA を組み込むようにすることができます。酵母ツーハイブリッドスクリーニングでは、別々のベイトおよびプレイプラスミドが同時に変異酵母株に導入されるか、または交配戦略を使用して両方のプラスミドを 1 つの宿主細胞に導入します。[ 9 ]
2つ目のハイスループットアプローチはライブラリースクリーニングアプローチです。この設定では、ベイトとプレイを保持する細胞がランダムな順序で交配されます。選択培地で交配して生存細胞を選択した後、科学者は分離されたプラスミドをシーケンスして、どのプレイ（DNA配列）が使用されたベイトと相互作用しているかを確認します。このアプローチは、マトリックスアプローチと比較して再現率が低く、偽陽性が多く発生する傾向があります。[ 9 ]
プラスミドは、DNA結合ドメイン（BD）断片がタンパク質に融合したタンパク質産物を生成するように設計され、別のプラスミドは、活性化ドメイン（AD）断片が別のタンパク質に融合したタンパク質産物を生成するように設計される。BDに融合したタンパク質はベイトタンパク質と呼ばれることがあり、通常は研究者が新しい結合パートナーを特定するために使用する既知のタンパク質である。ADに融合したタンパク質はプレータンパク質と呼ばれることがあり、単一の既知のタンパク質、または既知または未知のタンパク質のライブラリのいずれかである。この文脈では、ライブラリは、特定の生物または組織で発現するすべてのタンパク質を表すタンパク質コード配列のコレクションで構成されている場合もあれば、ランダムなDNA配列を合成することによって生成される場合もある。[ 3 ]出所に関係なく、それらはその後、プラスミドのタンパク質コード配列に組み込まれ、スクリーニング方法のために選択された細胞にトランスフェクションされる。[ 3 ]この技術は、ライブラリーを使用する場合、各細胞に単一のプラスミドのみがトランスフェクトされ、したがって各細胞は最終的にタンパク質ライブラリーから単一のメンバーのみを発現することを前提としています。
ベイトタンパク質とプレイタンパク質が相互作用（結合）すると、転写因子のADとBDが間接的に連結され、ADが転写開始部位に近づき、レポーター遺伝子の転写が起こる。2つのタンパク質が相互作用しない場合は、レポーター遺伝子の転写は起こらない。このように、融合タンパク質間の相互作用が成功すると、細胞の表現型の変化につながる。[ 1 ]
次のセクションでは、対応する融合タンパク質と相互作用するタンパク質を発現する細胞と、相互作用しないタンパク質を発現する細胞を分離するという課題について考察します。
どの研究においても、調査対象のタンパク質ドメインの一部は研究の目的に応じて変化させ、調査対象ではない他のドメインは一定に保たれます。たとえば、DNA結合ドメインを選択するためのツーハイブリッド研究では、DNA結合ドメインBDは変化させますが、相互作用する2つのタンパク質、ベイトとプレイは、BDとAD間の強い結合を維持するために一定に保つ必要があります。BD、ベイト、プレイ、ADを一定に保つためには、選択できるドメインが多数あります。タンパク質間相互作用の調査では、BDはZif268などの多くの強力なDNA結合ドメインのいずれかから選択できます。[ 2 ]ベイトドメインとプレイドメインの頻繁な選択は、それぞれN342V変異を持つ酵母Gal11Pの263～352番目の残基[ 2 ]と酵母Gal4の58～97番目の残基[ 2 ]です。これらのドメインは酵母および細菌ベースの選択技術の両方で使用でき、互いに強く結合することが知られています。[ 1 ] [ 2 ]
選択されたADは、細胞自身の転写機構を使用してレポーター遺伝子の転写を活性化できるものでなければなりません。したがって、酵母ベースの技術で使用できるさまざまなADは、細菌ベースの類似物での使用には適さない可能性があります。単純ヘルペスウイルス由来のAD、VP16、および酵母Gal4 ADは酵母で成功裏に使用されています[ 1 ]。一方、大腸菌RNAポリメラーゼのαサブユニットの一部は、大腸菌ベースの方法で使用されています。[ 2 ] [ 3 ]
強力な活性化ドメインは、弱い相互作用に対する感度を高める可能性がある一方で、逆に、弱い活性化ドメインは、より厳密な制御を提供する可能性がある。
ツーハイブリッド解析またはその派生技術を実施するには、多数の遺伝子操作配列を宿主細胞に組み込む必要がある。これらの配列の構築および導入における考慮事項と方法は、アッセイのニーズと実験対象生物として選択された生物によって異なる。
ハイブリッドライブラリーには、大きく分けてランダムライブラリーとcDNAベースライブラリーの2種類があります。cDNAライブラリーは、特定の細胞から採取したmRNAを逆転写して作製したcDNAで構成されます。このライブラリーは、アッセイで使用するBDまたはADに連結されるようにコンストラクトに連結することができます。[ 1 ]ランダムライブラリーは、これらのcDNAセクションの代わりにランダム配列のDNAを使用します。これらのランダム配列を作製する方法は数多くあり、カセット変異誘発法なども含まれます。[ 2 ] DNAライブラリーの由来に関わらず、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、関連するプラスミド/ファージミドの適切な場所に連結されます。[ 2 ]
ハイブリッドタンパク質をIPTG誘導性lacプロモーターの制御下に置くことで、IPTGを添加した培地でのみ発現させることができます。さらに、各遺伝子構築物に異なる抗生物質耐性遺伝子を含めることで、対応する抗生物質を含む培地で培養することにより、非形質転換細胞の増殖を容易に阻止できます。これは、細胞生存に相互作用の欠如が必要なカウンターセレクション法において特に重要です。 [ 2 ]
レポーター遺伝子は、まずエピソーム（細菌細胞ゲノムに組み込む能力を持つプラスミドの一種）に挿入することで、大腸菌ゲノムに挿入することができる[ 2 ]。エピソームのコピー数は細胞あたり約1である[ 10 ] 。
ハイブリッド発現ファージミドは、E. coli XL-1 Blue細胞にエレクトロポレーション法で導入することができ、増幅後、VCS-M13ヘルパーファージで感染すると、ライブラリーファージのストックが得られます。これらのファージはそれぞれ、ファージミドライブラリーの1本鎖メンバーを1つ含んでいます。[ 2 ]
選別が完了したら、適切な特性を示すタンパク質の一次構造を決定する必要がある。これは、適切な表現型を示す細胞から、タンパク質をコードする配列（最初に挿入された状態のまま）を取り出すことによって達成される。
大腸菌細胞を形質転換するために使用されたファージミドは、選択された細胞にVCS-M13ヘルパーファージを感染させることで「回収」することができる。生成されたファージ粒子には一本鎖ファージミドが含まれており、XL-1 Blue細胞に感染させるために使用される。[ 2 ]その後、これらのXL-1 Blue細胞から二本鎖ファージミドが回収され、実質的に元のライブラリーファージを生成するために使用されたプロセスを逆転させる。最後に、ジデオキシシークエンシングによってDNA配列が決定される。[ 2 ]
大腸菌由来のTet-Rリプレッサーは、従来のレポーター遺伝子と併用でき、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン（Tet-R阻害剤）によって制御できます。したがって、Tet-Rの発現は標準的なツーハイブリッドシステムによって制御されますが、Tet-Rは、Tet-Rプロモーターを介して、前述のHIS3などのレポーターの発現を制御（抑制）します。テトラサイクリンまたはその誘導体は、Tet-Rを利用するシステムの感度を調節するために使用できます。[ 1 ]
細胞のレポーター遺伝子への依存性を変化させることによっても、感受性を制御できる。例えば、his3依存性細胞の場合は増殖培地中のヒスチジン濃度を変化させ、 aadA依存性細胞の場合はストレプトマイシン濃度を変化させることで、これに影響を与えることができる。[ 2 ] [ 3 ]選択遺伝子への依存性は、選択遺伝子の阻害剤を適切な濃度で適用することによっても制御できる。例えば、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（3-AT）はHIS3遺伝子産物の競合阻害剤であり、ヒスチジン欠乏培地での増殖に必要なHIS3発現の最小レベルを滴定するために使用できる。 [ 2 ]
感度は、レポーターDNA中のオペレーター配列の数を変化させることによっても調整できる。
3番目の非融合タンパク質は、2つの融合タンパク質と共発現される可能性がある。調査によっては、3番目のタンパク質が融合タンパク質の1つを修飾したり、それらの相互作用を媒介または妨害したりする可能性がある。[ 1 ]
融合タンパク質の一方または両方の修飾または活性化には、第三のタンパク質の共発現が必要となる場合がある。例えば、S. cerevisiaeは内因性のチロシンキナーゼを持たない。チロシンリン酸化を必要とするタンパク質を研究する場合、キナーゼはチロシンキナーゼ遺伝子の形で供給されなければならない。[ 1 ]
非融合タンパク質は、リガンド依存性受容体二量体化の場合と同様に、両方の融合タンパク質に同時に結合することによって相互作用を媒介する可能性がある。[ 1 ]
相互作用するパートナーを持つタンパク質の場合、他のタンパク質との機能的相同性は、第三のタンパク質を非融合形態で供給することによって評価できます。この場合、第三のタンパク質は融合タンパク質と結合パートナーをめぐって競合する場合としない場合があります。第三のタンパク質と他の融合タンパク質との結合は、レポーター発現活性化複合体の形成を阻害し、レポーター発現を減少させ、表現型に特徴的な変化をもたらします。[ 1 ]
古典的な酵母ツーハイブリッドスクリーニングの限界の 1 つは、可溶性タンパク質に限定されていることです。そのため、不溶性の膜タンパク質間のタンパク質間相互作用を研究するためにこれらを使用することは不可能です。スプリットユビキチンシステムは、この限界を克服する方法を提供します。[ 11 ]スプリットユビキチンシステムでは、研究対象の 2 つの膜タンパク質が、2 つの異なるユビキチン部分、すなわち C 末端ユビキチン部分 (「Cub」、35 ～ 76 残基) と N 末端ユビキチン部分 (「Nub」、1 ～ 34 残基) に融合されます。これらの融合タンパク質は、それぞれベイトとプレイと呼ばれます。Cub 部分は、膜タンパク質に融合されていることに加えて、ユビキチン特異的プロテアーゼによって切断される転写因子(TF) にも融合されています。餌と獲物の相互作用により、NubとCubの部分が集合し、スプリットユビキチンが再構成される。再構成されたスプリットユビキチン分子は、ユビキチン特異的プロテアーゼによって認識され、転写因子が切断され、レポーター遺伝子の転写が誘導される。[ 12 ]
Zolghadr らは、異なる蛍光タンパク質とlac リプレッサーである LacI に融合した 2 つのハイブリッドタンパク質を使用する蛍光ツーハイブリッドシステムを発表しました。融合タンパク質の構造は、FP2-LacI-bait と FP1-prey のようで、bait タンパク質と prey タンパク質が相互作用し、蛍光タンパク質 (FP1 = GFP、FP2 = mCherry ) を宿主細胞ゲノム内の LacI タンパク質の結合部位に近接させます。 [ 13 ]このシステムは、タンパク質間相互作用の阻害剤をスクリーニングするためにも使用できます。[ 14 ]
オリジナルの Y2H システムは再構成された転写因子を使用していたが、他のシステムでは PPI を検出するために酵素活性を生成する。たとえば、キナーゼ基質センサー (「KISS」) は、細胞内 PPI をマッピングするために設計された哺乳類ツーハイブリッド法である。ここでは、ベイトタンパク質がTYK2のキナーゼ含有部分に融合され、プレーがgp130サイトカイン受容体断片に結合されている。ベイトとプレーが相互作用すると、TYK2 がプレーキメラ上のSTAT3ドッキング部位をリン酸化し、最終的にレポーター遺伝子の活性化につながる。[ 15 ]
2 ハイブリッド陽性をDNA シーケンスによって同定する戦略が数多く開発されており、通常はレポーター遺伝子を使用して選択した後で行われる。このアプローチの変種は最近Liquid Y2H-Seqとして記述された。[ 16 ] スタンレー・フィールズらが転写活性化アッセイを使用してタンパク質間相互作用を検出し、新規結合パートナーのライブラリーをスクリーニングできることを実証した後、この方法の実用性がすぐに確立された。1993 年、Vojtek らは、新規相互作用を同定するための最初の成功した 2 ハイブリッド スクリーニングを実施し、Ras GTPase が、以前は Ras の下流で遺伝的に機能することが知られていたタンパク質である RAF キナーゼに物理的に結合することを発見した。[ 17 ]その後のマイルストーンはジョンズ ホプキンス大学 で発生し、アントン・ユリエフはRNA ポリメラーゼ II の C 末端ドメイン (CTD) と相互作用する 2 つの新規タンパク質ファミリーを同定した。これらのファミリーは、高度に相同なCTD相互作用ドメイン（CID）によって特徴付けられ、相互作用の機能的重要性に関する構造的証拠を提供した。これらのタンパク質は既知のスプライシング因子とも相同性を示したため、この発見は、CTDが真核生物において遺伝子転写とmRNAプロセシングを物理的に連結する機能を持つことを示唆した。ユーリエフは後に、RAFキナーゼの3つのアイソフォームを使用して実証された、アイソフォーム特異的な結合パートナーの選択を通じて機能的相互作用を特定する技術を提案することで、この方法論を拡張した。[ 18 ]
この技術のワンハイブリッド変種は、タンパク質とDNAの相互作用を調査するために設計されており、ADが結合ドメインに直接連結された単一の融合タンパク質を使用します。結合ドメインはライブラリーで構成され、目的の標的配列（レポーター遺伝子のプロモーター領域に挿入されている）に結合するタンパク質を選択できます。ポジティブセレクションシステムでは、UASにうまく結合して転写を可能にする結合ドメインが選択されます。[ 1 ]
DNA結合ドメインの選択は必ずしもワンハイブリッドシステムを使用して行われるわけではなく、結合ドメインを変化させ、ベイトタンパク質とプレイタンパク質を一定に保つツーハイブリッドシステムを使用しても行われる場合があることに注意してください。[ 2 ] [ 3 ]
ワンハイブリッドスクリーニングは、タンパク質の転写活性化特性を調べるために使用できます。これは、DNA結合ドメインに融合した酵母タンパク質の大規模なスクリーニングで行われ、融合タンパク質はレポーター遺伝子の転写を単純に活性化しました。これにより、酵母には451の転写活性化因子が明らかになり、そのうち132は強力な活性化因子でした。[ 19 ]
RNA-タンパク質相互作用は、ツーハイブリッド法のスリーハイブリッド法によって研究されてきた。この場合、ハイブリッドRNA分子は、互いに相互作用するのではなく、中間RNA分子（RNA結合ドメインを介して）と相互作用するように設計された2つのタンパク質融合ドメインを連結する役割を果たす。[ 1 ]上記の「非融合タンパク質」の項で説明したように、同様の機能を果たす非融合タンパク質を用いた手法も、スリーハイブリッド法と呼ばれることがある。
ワンハイブリッド法とツーハイブリッド法（すなわち、タンパク質間相互作用とタンパク質-DNA相互作用の同時測定）の同時使用は、ワンツーハイブリッド法として知られており、スクリーニングの厳密性を高めることが期待されている。[ 1 ]
理論的には、どの生細胞でもツーハイブリッド解析の背景として使用できますが、実際にどの細胞を選択するかは、いくつかの実用的な考慮事項によって決まります。選択された細胞株は、比較的安価で培養が容易であり、調査方法や試薬の適用に耐えられるほど十分に頑丈である必要があります。[ 1 ]後者は、ハイスループット研究を行う上で特に重要です。そのため、酵母S. cerevisiaeはツーハイブリッド研究の主要な宿主生物となっています。しかし、他の生物の相互作用タンパク質を研究するのに常に理想的なシステムとは限りません。[ 20 ]酵母細胞は、同じ翻訳後修飾を持たないことが多く、コドン使用が異なり、タンパク質の正しい発現に重要な特定のタンパク質を欠いています。これらの問題に対処するために、いくつかの新しいツーハイブリッドシステムが開発されました。使用するシステムに応じて、寒天プレートまたは特定の増殖培地を使用して細胞を培養し、相互作用の選択を可能にします。最も一般的に使用される方法は寒天プレーティング法で、細胞を選択培地にプレーティングして相互作用が起こるかどうかを確認します。相互作用タンパク質を持たない細胞は、この選択培地では生存できないはずである。[ 7 ] [ 21 ]
酵母S. cerevisiaeは、ツーハイブリッド法の黎明期に使用されたモデル生物です。これは一般的にY2Hシステムとして知られています。酵母には、三次タンパク質構造を形成する能力、中性の内部pH、ジスルフィド結合を形成する能力の向上、還元型グルタチオンなどの細胞質緩衝因子など、相互作用をホストするのに適した堅牢な生物となるいくつかの特徴があり、これらによって好ましい内部環境を維持します。[ 1 ]酵母モデルは非分子技術によって操作することができ、その完全なゲノム配列は既知です。[ 1 ]酵母システムは、哺乳類組織培養には適用できない多様な培養条件や過酷な化学物質に対して耐性があります。[ 1 ]
Y2Hスクリーニング専用に作られた酵母株がいくつかあり、例えばClontech社製のY187 [ 22 ]やAH109 [ 23 ]などがある。酵母株R2HMetやBK100も使用されている。[ 24 ]
C. albicansは、CUG コドンをロイシンではなくセリンに翻訳するという特徴を持つ酵母です。このコドン使用法の違いにより、 C. albicans の遺伝子を使用してタンパク質間相互作用を調べるために、モデルシステムS. cerevisiaeを Y2H として使用することは困難です。よりネイティブな環境を提供するために、 C. albicansツーハイブリッド (C2H) システムが開発されました。このシステムを使用すると、 C. albicans自体でタンパク質間相互作用を研究できます。 [ 25 ] [ 26 ]最近では、ハイスループットシステムが構築されました。 [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ]
細菌ツーハイブリッド法（B2HまたはBTH）は通常大腸菌で行われ、酵母ベースのシステムに比べていくつかの利点があります。例えば、形質転換効率が高く、成長速度が速いため、大腸菌ではより大きなライブラリー（ 10⁸以上）を使用できます。[ 2 ]タンパク質配列に核局在シグナルを含める必要がないこと、酵母に毒性のあるタンパク質を研究できることも、実験用バックグラウンド生物を選択する際に考慮すべき重要な要素です。[ 2 ]
大腸菌の特定のDNAメチルトランスフェラーゼタンパク質のメチル化活性は、一部のDNA結合タンパク質の選択を妨げる可能性があります。これが予想される場合は、特定のメチルトランスフェラーゼに欠陥のある大腸菌株を使用することが明らかな解決策となる可能性があります。 [ 2 ] B2Hは、タンパク質が真核細胞のように折り畳まれなかったり、他の処理が欠けていたりするため、真核生物のタンパク質間相互作用（例えばヒトタンパク質）を研究する際には理想的ではない可能性があります。
近年、哺乳類タンパク質の相互作用を、天然のタンパク質環境を忠実に模倣した細胞環境で研究するために、哺乳類ツーハイブリッド（M2H）システムが設計されました。[ 30 ]このシステムでは、タンパク質間相互作用を見つけるために、一時的にトランスフェクトされた哺乳類細胞が使用されます。[ 31 ] [ 32 ] 哺乳類細胞株を使用して哺乳類タンパク質の相互作用を研究すると、より天然に近い環境で作業できるという利点があります。[ 5 ] 翻訳後修飾、リン酸化、アシル化、グリコシル化は類似しています。タンパク質の細胞内局在も、酵母ツーハイブリッドシステムを使用する場合と比較してより正確です。[ 33 ] [ 34 ] 哺乳類ツーハイブリッドシステムでは、シグナル入力を研究することも可能です。[ 35 ] もう一つの大きな利点は、トランスフェクション後48時間以内に結果が得られることです。[ 5 ]
2005年に植物における2つのハイブリッドシステムが開発されました。シロイヌナズナのプロトプラストを使用することで 、植物におけるタンパク質間相互作用を研究できます。この方法では、相互作用を本来のコンテキストで研究できます。このシステムでは、GAL4 ADとBDは強力な35Sプロモーターの制御下にあります。相互作用はGUSレポーターを使用して測定されます。ハイスループットスクリーニングを可能にするために、ベクターはGateway互換になりました。このシステムはプロトプラスト2ハイブリッド（P2H）システムとして知られています。[ 36 ]
アメフラシA. californicaは、長期記憶の分子メカニズムなどを研究するための神経生物学のモデル生物です。神経学において重要な相互作用をより自然な環境で研究するために、A. californicaニューロンでツーハイブリッドシステムが開発されました。このシステムでは、GAL4 AD と BD が使用されています。[ 37 ] [ 38 ]
カイコガ（ Bombyx mori ）の幼虫または毛虫由来のカイコ細胞株（BmN4細胞）で昆虫ツーハイブリッド（I2H）システムが開発された。このシステムはGAL4 BDとマウスNF-κB P65の活性化ドメインを使用している。どちらもOpIE2プロモーターの制御下にある。[ 39 ]
使用するプラスミド中の対応するDNA塩基対を突然変異させることで特定のアミノ酸を変化させ、相互作用を維持する上でのそれらのアミノ酸残基の重要性を決定することができる。[ 1 ]
細菌細胞ベースの方法を用いてDNA結合タンパク質を選択した後、細菌細胞ゲノムが他の配列（あるいは実際にはDNA全般）に対する親和性を持つドメインのシンクとして機能する範囲には限界があるため、これらのドメインの特異性を確認する必要がある。[ 2 ]
タンパク質間シグナル伝達相互作用は、その特異性と普遍性から、適切な治療標的となる。ランダム創薬アプローチでは、ランダムな化学構造からなる化合物バンクを使用し、これらの構造を目的の標的でテストするためにハイスループット法が必要となる。[ 1 ] [ 21 ]
調査のために選択された細胞は、研究者が研究しようとしている分子的な側面を反映するように特別に設計することができ、その後、新しいヒトまたは動物の治療薬や殺虫剤を特定するために使用できます。[ 1 ] [ 21 ]
未知のタンパク質の相互作用パートナーを決定することで、これらの新しいタンパク質の可能性のある機能を推測することができます。[ 1 ]これは、既知の単一のタンパク質を未知のタンパク質のライブラリに対して使用することによって行うこともできますし、逆に、機能が未知の単一のタンパク質を使用して既知のタンパク質のライブラリから選択することによって行うこともできます。[ 1 ]
タンパク質工学のために亜鉛フィンガータンパク質（ZFP）を選択するために、ツーハイブリッドスクリーニング技術から応用された方法が成功裏に使用されてきた。[ 2 ] [ 3 ] ZFP自体は、目的のDNA配列に結合するカスタムDNA結合ドメインの構築に使用されるDNA結合タンパク質である。[ 40 ]
UASに目的の標的配列を含む選択遺伝子を使用し、関連するアミノ酸配列をランダム化してZFPライブラリーを作成することにより、必要な特性を持つDNA-ZFP相互作用を有する細胞を選択できる。各ZFPは通常3～4塩基対しか認識しないため、UAS外の部位の認識を防ぐために、ランダム化されたZFPは、一定配列の別の2つのZFPからなる「足場」に組み込まれる。したがって、UASは、ZFPが選択される配列に加えて、一定足場の標的配列を含むように設計される。[ 2 ] [ 3 ]
このシステムを使えば、他の多くのDNA結合ドメインも調査できる可能性がある。[ 2 ]
この高いエラー率の原因は、画面の特性にある。
これらの各点だけでも誤った結果が生じる可能性があります。すべてのエラー源の複合的な影響により、酵母ツーハイブリッド法は慎重に解釈する必要があります。偽陽性が発生する可能性は、すべての相互作用を、例えば内因性タンパク質の共免疫沈降などの高信頼性アッセイで確認する必要があることを意味しますが、これは大規模なタンパク質間相互作用データでは困難です。あるいは、Y2Hデータは、複数のY2Hバリアント[ 42 ]またはバイオインフォマティクス技術を使用して検証できます。後者は、相互作用するタンパク質が同時に発現しているか、いくつかの共通の特徴（遺伝子オントロジー注釈や特定のネットワークトポロジーなど）を共有しているか、他の種で相同な相互作用を持っているかをテストします。[ 43 ]