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タンパク質マイクロアレイ（またはタンパク質チップ）は、タンパク質の相互作用と活性を追跡し、その機能を大規模に決定するために使用されるハイスループット法です。 [ 1 ]その主な利点は、多数のタンパク質を並行して追跡できることです。チップは、ガラススライド、ニトロセルロース膜、ビーズ、またはマイクロタイタープレートなどの支持面で構成され、そこに捕捉タンパク質のアレイが結合されています。[ 2 ]プローブ分子（通常は蛍光色素で標識）がアレイに追加されます。プローブと固定化されたタンパク質との間の反応は、レーザースキャナによって読み取られる蛍光信号を発します。[ 3 ]タンパク質マイクロアレイは、迅速、自動化、経済的、高感度であり、少量のサンプルと試薬を消費します。[ 4 ]タンパク質マイクロアレイの概念と方法は、 1983年に科学論文[ 5 ]と一連の特許で抗体マイクロアレイ（抗体マトリックスとも呼ばれる）で初めて紹介され、説明されました。 [ 6 ]タンパク質マイクロアレイの背後にあるハイスループット技術は、DNAマイクロアレイ用に開発された技術に基づいているため、比較的容易に開発できました。 [ 7 ] DNAマイクロアレイは、最も広く使用されているマイクロアレイとなっています。
プロテオミクスにおける遺伝子発現レベルの決定にDNAマイクロアレイを使用する際の限界から、プロテインマイクロアレイが開発されました。細胞内のmRNAの量は、それに対応するタンパク質の発現レベルを反映しないことがよくあります。細胞応答において機能的な役割を果たすのは通常mRNAではなくタンパク質であるため、新しいアプローチが必要でした。さらに、タンパク質の機能を決定する上で重要なことが多い翻訳後修飾は、DNAマイクロアレイでは見えません。[ 8 ]プロテインマイクロアレイは、時間と労力がかかり、低存在量のタンパク質の分析には不向きであった2Dゲル電気泳動やクロマトグラフィーなどの従来のプロテオミクス技術に取って代わります。
タンパク質は、顕微鏡スライド、メンブレン、ビーズ、マイクロタイタープレートなどの固体表面に配列されます。この表面の機能は、タンパク質を固定化するための支持体を提供することです。タンパク質の結合能力を維持するために、タンパク質を天然の立体構造に保ちながら、最大限の結合特性を示す必要があります。ガラスまたはシリコン製の顕微鏡スライドは、DNAマイクロアレイ技術用に開発された入手しやすいロボットアレイヤーやレーザースキャナーと互換性があるため、よく使用されます。ニトロセルロースフィルムスライドは、タンパク質マイクロアレイ用途において、最も高いタンパク質結合性を持つ基板として広く認められています。
選択された固体表面は、タンパク質の固定化、変性防止、結合部位にアクセス可能な適切な方向への配向、および結合反応が起こる親水性環境の提供という機能を同時に果たすコーティングで覆われます。また、検出システムにおけるバックグラウンドノイズを最小限に抑えるため、非特異的結合が最小限である必要があります。さらに、さまざまな検出システムとの互換性も必要です。固定化剤としては、アルミニウムまたは金の層、親水性ポリマー、ポリアクリルアミドゲル、あるいはアミン、アルデヒド、エポキシによる処理などが挙げられます。支持体表面へのコーティングの塗布には、物理蒸着（PVD）や化学蒸着（CVD）などの薄膜技術が用いられます。
タンパク質の変性を防ぐため、アレイの製造および操作の全段階において、水性環境が不可欠です。そのため、サンプルバッファーには高濃度のグリセロール（凝固点を下げるため）が含まれており、製造環境の湿度は厳密に管理されています。マイクロウェルは、水性環境を提供すると同時にサンプル間の相互汚染を防ぐという二重の利点があります。
最も一般的なタイプのタンパク質アレイでは、ロボットが多数のタンパク質またはそのリガンドを、あらかじめ定義されたパターンでコーティングされた固体支持体上に配置し、ロボット接触印刷またはロボットスポッティングとして知られています。別の製造方法はインクジェット印刷で、これはドロップオンデマンドの非接触方式で、タンパク質ポリマーを固体表面に所望のパターンで分散させます。[ 9 ]ピエゾ電気スポッティングはインクジェット印刷と同様の方法です。プリントヘッドがアレイ上を移動し、各スポットで電気刺激を使用して、微細なジェットを介してタンパク質分子を表面に供給します。これも非接触プロセスです。[ 10 ]フォトリソグラフィーは、タンパク質を表面に配列する4番目の方法です。光はフォトマスクと組み合わせて使用されます。フォトマスクは、定義されたパターンで光を透過させる穴または透明部分のある不透明なプレートです。その後、一連の化学処理により、フォトマスクの下の材料上に所望のパターンでタンパク質を堆積させることができます。[ 11 ]
固体表面に配列される捕捉分子は、抗体、抗原、アプタマー（核酸ベースのリガンド）、アフィボディ（モノクローナル抗体を模倣するように設計された小分子）、または全長タンパク質である。これらのタンパク質の供給源としては、組換えタンパク質用の細胞ベースの発現系、天然物からの精製、無細胞翻訳系によるin vitro生産、およびペプチドの合成法などが挙げられる。これらの方法の多くは、ハイスループット生産のために自動化できるが、合成または抽出の条件によってタンパク質が変性し、結合パートナーを認識できなくなるとアレイが使用できなくなるため、注意が必要である。
タンパク質は微小環境の変化に非常に敏感です。そのため、タンパク質アレイを長期間にわたって安定した状態に維持することが困難です。 2001年にMingyue HeとMichael Taussigによって発明され発表されたin situ法[ 12 ] [ 13 ]は、無細胞タンパク質発現システムを使用して、必要に応じてDNAから直接チップ上でタンパク質を合成します。DNAは非常に安定した分子であるため、時間の経過とともに劣化せず、長期保存に適しています。このアプローチは、タンパク質がチップ表面上で単一のステップで同時に合成され固定化されるため、別々に行われる手間のかかる高コストなタンパク質精製とDNAクローニングのプロセスを回避できるという利点もあります。in situ技術の例としては、PISA（タンパク質in situアレイ）、NAPPA（核酸プログラム可能タンパク質アレイ）、DAPA（DNAアレイからタンパク質アレイ）などがあります。
現在、タンパク質の生化学的活性を研究するために用いられているタンパク質マイクロアレイには、主に3種類ある。
分析用マイクロアレイは、キャプチャーアレイとも呼ばれます。この技術では、抗体、アプタマー、またはアフィボディのライブラリーが支持体表面に配列されます。これらはそれぞれ特定のタンパク質に特異的に結合するため、キャプチャー分子として使用されます。アレイは、細胞溶解液などの複雑なタンパク質溶液でプローブされます。様々な検出システムを用いて得られた結合反応を分析することで、サンプル中の特定のタンパク質の発現レベルに関する情報や、結合親和性および特異性の測定値を得ることができます。このタイプのマイクロアレイは、異なる溶液中のタンパク質発現を比較するのに特に有用です。例えば、特定の物質で処理した細胞や特定の条件下で培養した細胞の溶解液を対照細胞の溶解液と比較することで、特定の因子に対する細胞の応答を特定できます。また、病変組織の同定やプロファイリングにも応用されています。
逆相タンパク質マイクロアレイ（RPPA）は、組織溶解物などの複雑なサンプルを扱います。細胞は、対象となるさまざまな組織から分離され、溶解されます。溶解物はマイクロアレイ上にアレイ化され、目的の標的タンパク質に対する抗体でプローブされます。これらの抗体は通常、化学発光、蛍光、または比色アッセイで検出されます。参照ペプチドは、サンプル溶解物のタンパク質定量を可能にするためにスライド上に印刷されます。RPAは、疾患の結果として生じる可能性のある変化したタンパク質またはその他の因子の存在を判定することを可能にします。特に、疾患の結果として通常変化する翻訳後修飾は、RPAを使用して検出できます。[ 14 ]
機能性タンパク質マイクロアレイ（ターゲットタンパク質アレイとも呼ばれる）は、精製された多数のタンパク質を固定化して作製され、タンパク質間、タンパク質-DNA、タンパク質-RNA、タンパク質-リン脂質、およびタンパク質-低分子間の相互作用の同定、酵素活性の測定、抗体の検出およびその特異性の実証に用いられる。機能性タンパク質アレイは、全長機能性タンパク質またはタンパク質ドメインを含むアレイで構成されている点で、分析用アレイとは異なる。これらのタンパク質チップは、単一の実験でプロテオーム全体の生化学的活性を研究するために使用される。
機能性タンパク質マイクロアレイを用いたアッセイにおいて重要な要素は、アレイ化されたタンパク質が天然構造を維持し、アレイ表面上で意味のある機能的相互作用が起こらなければならないことである。適切なアフィニティタグを用いて表面への固定化の正確な様式を制御する利点は、固定化されたタンパク質が均一な配向を持ち、アッセイにおける比活性と信号対雑音比が高くなり、非特異的相互作用による干渉が少なくなることである。[ 15 ] [ 16 ]
タンパク質アレイ検出法は、高いシグナルと低いバックグラウンドを示す必要があります。最も一般的で広く使用されている検出方法は蛍光標識法で、これは高感度で安全であり、市販のマイクロアレイレーザースキャナと互換性があります。アフィニティタグ、光化学タグ、放射性同位体タグなどの他のラベルも使用できます。これらのラベルはプローブ自体に付着しており、プローブと標的タンパク質の反応を妨害する可能性があります。そのため、表面プラズモン共鳴（SPR）、カーボンナノチューブ、カーボンナノワイヤセンサー（コンダクタンスの変化によって検出が行われる）、マイクロ電気機械システム（MEMS）カンチレバーなど、ラベルフリーの検出法が数多くあります。[ 17 ]これらのラベルフリーの検出法はすべて比較的新しく、まだハイスループットのタンパク質相互作用検出には適していませんが、将来に向けて大きな可能性を秘めています。チオール-エン「合成紙」マイクロピラー足場上の免疫測定法は、優れた蛍光シグナルを生成することが示されています。[ 18 ]
ニトロセルロースコーティングされたガラススライド上のタンパク質定量には、近赤外蛍光検出法を用いることができる。これにより、標準的な蛍光検出プローブに使用される紫外線波長におけるニトロセルロースの自家蛍光による干渉が抑制される。[ 19 ]
タンパク質アレイが応用されている主な分野は、診断、プロテオミクス、タンパク質機能解析、抗体特性解析、治療法開発の5つである。
診断には、血液サンプル中の抗原と抗体の検出、新しい疾患バイオマーカーを発見するための血清のプロファイリング、個別化医療における疾患状態と治療への反応のモニタリング、環境と食品のモニタリングが含まれます。デジタルバイオアッセイは、診断目的でタンパク質マイクロアレイを使用する例です。この技術では、ガラス/ポリマーチップ上のマイクロウェルアレイに磁気ビーズ（蛍光標識抗体でコーティング）を播種し、標的抗原に曝露した後、蛍光を発するウェルを数えることで顕微鏡で特性評価します。このようなマイクロウェルアレイ用の費用対効果の高い製造プラットフォーム（OSTEポリマーを使用）が最近実証され、バイオアッセイモデルシステムがうまく特性評価されています。[ 20 ]
プロテオミクスとは、タンパク質発現プロファイリング、すなわち特定の細胞の溶解液中にどのタンパク質が発現しているかを調べる学問である。
タンパク質の機能解析とは、タンパク質間相互作用（例えば、タンパク質複合体の構成要素の同定）、タンパク質とリン脂質の相互作用、低分子標的、酵素基質（特にキナーゼの基質）、および受容体リガンドの同定のことである。
抗体特性解析とは、交差反応性、特異性、およびエピトープのマッピングを特徴づけることである。
マイクロアレイは、自己抗体の検出にも使用でき、自己抗原アレイを利用して、多くの抗原または潜在的な抗原に対して並行してスクリーニングを行うことができます。[ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]
治療法の開発には、自己免疫疾患、がん、アレルギーに対する抗原特異的な治療法の開発、および新規医薬品として使用できる可能性のある低分子標的の特定が含まれる。
複数の企業が多額の投資を行っているにもかかわらず、タンパク質チップはまだ市場に普及していません。製造業者は、タンパク質の取り扱いが非常に難しいことを発見しました。正しく折り畳まれ、機能する、信頼性が高く、一貫性のある、高スループットのタンパク質を製造することは困難を伴います。溶解度の低下や封入体の形成により、タンパク質の収量が低くなることが多いためです。タンパク質チップの製造には、 DNAチップよりもはるかに多くの工程が必要です。
この問題に対するアプローチはいくつかあり、タンパク質が非特異的で定義が曖昧な相互作用によって固定されるか、既知の特定の相互作用によって固定されるかによって根本的に異なります。前者のアプローチは、その単純さで魅力的であり、天然または組換え由来の精製タンパク質と互換性がありますが[ 24 ] [ 25 ]、いくつかのリスクがあります。その中でも最も注目すべきは、各タンパク質と表面との間の相互作用が制御されていない性質に関係しています。最良の場合でも、活性部位が表面によって遮られることがある不均一なタンパク質集団が生じる可能性があります。最悪の場合、固定化されたタンパク質の表面を介した部分的または完全な展開により、活性が完全に失われる可能性があります。
課題としては、1) タンパク質が二次構造または三次構造、ひいては生物学的活性および他の分子との相互作用を維持できるような表面および結合方法を見つけること、2) チップ上のタンパク質が短期間で変性しないように、長期保存可能なアレイを作成すること、3) ヒトゲノムのすべてのタンパク質に対する抗体またはその他の捕捉分子を同定および単離すること、4) 感度を確保しバックグラウンドノイズを回避しながら結合タンパク質のレベルを定量化すること、5) さらに分析するために検出されたタンパク質をチップから抽出すること、6) 捕捉剤による非特異的結合を低減すること、7) チップの容量は、プロテオームの可能な限り完全な表現を視覚化できるように十分でなければならない。豊富に存在するタンパク質は、一般的に治療上の関心が高いシグナル伝達分子や受容体などの、存在量の少ないタンパク質の検出を圧倒する。[ 26 ]