プライマーダイマー

プライマー設計ソフトウェアは、DNA二次構造形成の可能性や、プライマー同士またはプライマーペア内でのプライマーのアニーリングの可能性をチェックするアルゴリズムを使用します。ソフトウェアが考慮する物理的パラメータは、プライマーの潜在的な自己相補性とGC含量、プライマーの類似した融解温度、およびDNA標的配列におけるステムループなどの二次構造の欠如です。^{[ 2 ]}

プライマーは互いに相補性が低いように設計されているため、反応混合物の調製中など、室温などの低温でのみアニーリング（図のステップ I）する可能性があります。PCR で使用される DNA ポリメラーゼは 70  °C 付近で最も活性が高いですが、より低い温度でも重合活性があり、プライマー同士がアニーリングした後に DNA 合成を引き起こす可能性があります。^{[ 3 ]}反応が 60～70 °C の動作温度に達するまで PD の形成を防ぐためにいくつかの方法が開発されており 、これには DNA ポリメラーゼの初期阻害、または反応混合物がより高い温度に達するまで反応成分を物理的に分離することが含まれます。これらの方法はホットスタート PCRと呼ばれます。

ワックス：この方法では、酵素は反応混合物からワックスによって空間的に分離され、反応が高温に達するとワックスが溶ける。^{[ 4 ]}

マグネシウムの徐放：DNAポリメラーゼは活性にマグネシウムイオンを必要とするため^{[ 5 ]}、マグネシウムは化学化合物に結合することで反応から化学的に分離され、高温でのみ溶液中に放出される^{[ 6 ]。}

阻害剤の非共有結合：この方法では、ペプチド、抗体^{[ 7 ]}またはアプタマー^{[ 8 ]}が低温で酵素に非共有結合し、その活性を阻害します。95  ℃で1～5分間インキュベートした後、阻害剤が放出され、反応が開始されます。

低温感受性Taqポリメラーゼ：低温ではほとんど活性を示さない改変型DNAポリメラーゼである。^{[ 9 ]}

化学修飾：この方法では、DNAポリメラーゼの活性部位にあるアミノ酸の側鎖に小さな分子が共有結合されます。この小さな分子は、反応混合物を95 ℃で10～15分間インキュベートすることにより酵素から遊離されます。小さな分子が遊離すると、酵素が活性化されます。^{[ 10 ]} 

PD形成を防止または軽減するもう一つの方法は、プライマーを改変して、プライマー同士またはプライマー同士がアニーリングしても伸長反応が起こらないようにすることである。

HANDS（Homo -Tag A sisted Non- Dimer System ^{[ 11} ] ） ：プライマーの3 ^'末端に相補的なヌクレオチドテールがプライマーの5'末端に追加されます。5'テールはプライマーの3'末端に近接しているため、プライマーにアニーリングします。その結果、短いオーバーラップを含むアニーリングを排除しつつ、ターゲット内の完全に相補的な配列へのプライマーのアニーリングを可能にするステムループプライマーが得られます。

キメラプライマー：プライマー中の一部のDNA塩基がRNA塩基に置き換えられ、キメラ配列が作られます。キメラ配列と別のキメラ配列の融解温度は、キメラ配列とDNAの融解温度よりも低くなります。この違いにより、プライマーがターゲット配列にはアニーリングするが、他のキメラプライマーにはアニーリングしないようにアニーリング温度を設定できます。^{[ 12 ]}

ブロック切断プライマー： RNase H依存性PCR（rhPCR）として知られる方法^{[ 13 ]}は、耐熱性RNase HIIを利用して、高温でPCRプライマーからブロック基を除去します。このRNase HII酵素は低温ではほとんど活性を示さないため、ブロックの除去は高温でのみ起こります。この酵素はプライマーとテンプレートのミスマッチを識別する固有の能力も持っているため、プライマーダイマーに対する選択性も高まります。

自己回避型分子認識システム（SAMRSとも呼ばれる）^{[ 14 ]}は、プライマーにヌクレオチド類似体T*、A*、G*、C*を導入することでプライマーダイマーを排除します。SAMRS DNAは天然DNAには結合できますが、同じSAMRS種の他のメンバーには結合できません。例えば、T*はAには結合できますがA*には結合できず、A*はTには結合できますがT*には結合できません。このように、慎重な設計により^{[ 15 ]} 、 SAMRSから構築されたプライマーはプライマー間の相互作用を回避し、高感度SNP検出やマルチプレックスPCRを可能にします。

上記の方法はPD形成を抑制することを目的としていますが、別のアプローチでは定量PCRにおけるPDから発生するシグナルを最小限に抑えることを目指しています。このアプローチは、形成されるPDが少なく、産物蓄積に対する阻害効果が小さい場合に有効です。

4段階PCR：SYBR Green Iなどの非特異的色素を使用する場合に使用されます。これは、PDとターゲット配列の長さの違い、したがって融解温度の違いに基づいています。この方法では、シグナルはターゲット配列の融解温度より低く、PDの融解温度より高く取得されます。^{[ 16 ]}

配列特異的プローブ：TaqManプローブと分子ビーコンプローブは、標的（相補的）配列が存在する場合にのみシグナルを生成するため、この特異性の向上により、PDからのシグナル取得（ただし、製品蓄積に対する阻害効果の可能性は除く）が防止されます。