タンパク質結晶化

タンパク質の結晶化は、結晶接触によって安定化された個々のタンパク質分子の規則的な配列の形成プロセスです。結晶が十分に整列すると、回折します。一部のタンパク質は、眼の水晶体のアクアポリンのように、自然に結晶配列を形成します。 ^{[1] [2]}

タンパク質結晶化の過程では、タンパク質は水性環境とサンプル溶液に溶解され、過飽和状態に達する。^[3]その状態に達するために、蒸気拡散、マイクロバッチ、マイクロ透析、自由界面拡散などのさまざまな方法が使用されます。 タンパク質結晶の開発は、pH、温度、結晶化溶液中のイオン強度、さらには重力など、多くの要因の影響を受ける困難なプロセスです。^{[3]形成されたこれらの結晶は、特にさまざまな産業または医療目的で、}構造生物学でタンパク質の分子構造を研究するために使用できます。 ^{[4] [5]}

150年以上もの間、世界中の科学者はタンパク質分子の結晶化について知っていました。^[6]

1840年、フリードリヒ・ルートヴィヒ・ヒューネフェルトは、2枚のスライドガラスの下に置いたミミズの血液サンプルに結晶物質が形成されることを偶然発見し、乾燥した豚や人間の血液サンプルに小さな板状の結晶が時々見られることを発見しました。これらの結晶は、1864年にフェリックス・ホッペ・ザイラーによって「ヘモグロビン」と名付けられました。ヒューネフェルトの独創的な発見は、その後多くの科学者に影響を与えました。^[7]

1851年、オットー・フンケは、赤血球を純水、アルコール、エーテルなどの溶媒で希釈し、タンパク質溶液から溶媒をゆっくりと蒸発させることで、人間のヘモグロビン結晶を生成するプロセスについて説明しました。1871年、イエナ大学の教授ウィリアム・T・プレーヤは、「Die Blutkrystalle（血液の結晶）」と題する本を出版し、約50種の哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類のヘモグロビン結晶の特徴をレビューしました。^[7]

1909年、生理学者のエドワード・T・ライヒャートは鉱物学者のエイモス・P・ブラウンと共同で、タスマニアオオカミなどの絶滅種を含む数百種の動物から採取したヘモグロビン結晶の調製、生理学、幾何学的特徴に関する論文を発表しました。^[7]タンパク質結晶の増加が発見されました。

1934年、ジョン・デズモンド・バーナルと彼の学生ドロシー・ホジキンは、タンパク質結晶が母液に囲まれていると、乾燥した結晶よりも回折パターンが優れていることを発見しました。彼らはペプシンを使用して、湿った球状タンパク質の回折パターンを初めて識別しました。バーナルとホジキン以前は、タンパク質結晶構造解析は乾燥した状態でのみ行われ、結果は一貫性がなく信頼性が低かったです。これはタンパク質結晶の最初のX線回折パターンです。^[8]

1958年、ジョン・ケンドリューはX線結晶構造解析によってミオグロビン（ヘムを含む赤色のタンパク質）の構造を初めて報告した。^{[9]ケンドリューはこの発見により}マックス・ペルツと共に1962年のノーベル化学賞を共同受賞した。^[4]

現在、タンパク質結晶に基づいて、その構造は生化学やトランスレーショナルメディシンにおいて重要な役割を果たしています。

タンパク質の結晶化は、無機結晶の形成を支配するのと同じ物理学によって支配されています。結晶化が自発的に起こるためには、結晶状態が熱力学的に有利でなければなりません。これは、ギブスの自由エネルギー(∆G) によって記述され、∆G = ∆H- T∆S と定義され、プロセスのエンタルピー変化 ∆H が、対応するエントロピー変化∆Sとどのようにトレードオフするかを捉えています。 ^[10]エントロピーは、大まかに言えば、システムの無秩序さを表します。タンパク質結晶などの高度に秩序化された状態は、溶媒中のタンパク質溶液などのより無秩序な状態と比較して、熱力学的に不利です。これは、より秩序化された状態への遷移がシステムの総エントロピーを減少させるためです (負の ∆S)。結晶が自発的に形成されるためには、結晶形成の ∆G が負でなければなりません。言い換えれば、エントロピーのペナルティは、システムの全エネルギー (∆H) の対応する減少によって支払われる必要がある。塩化ナトリウムなどのよく知られた無機結晶は、結晶状態がシステムの全エネルギーを減少させるため、常温で自然に形成される。しかし、常温でのタンパク質の結晶化は、システムのエントロピー (負の ∆S) を減少させ、全エネルギー (正の ∆H) を増加させるため、自然には起こらない。このようなタンパク質の結晶化を達成するには、結晶形成がエネルギー的に有利になるように条件を変更する。これは、サンプルの過飽和溶液を作成することによって達成されることが多い。 ^[3]

結晶形成には、核形成と成長という2つのステップが必要です。^[3]核形成は結晶化の開始ステップです。^[3]核形成段階では、溶液中のタンパク質分子が凝集体として集まり、安定した固体の核を形成します。^[3]核が形成されると、この安定した核に分子が付着して結晶がどんどん大きくなります。^[3]核形成ステップは、サンプルが高い自由度から秩序ある状態（水性から固体）に移行する一次相転移であるため、結晶形成にとって重要です。 ^[3]核形成ステップを成功させるには、結晶化パラメータの操作が不可欠です。タンパク質を結晶化させるためのアプローチは、溶液中の標的タンパク質の溶解度を低下させることです。^[3]溶解度限界を超えて結晶が存在すると、結晶化が達成されます。^[3]

蒸気拡散法は、タンパク質結晶化の最も一般的に用いられる方法です。この方法では、精製されたタンパク質、緩衝液、沈殿剤を含む液滴を、より高濃度の同様の緩衝液と沈殿剤を含むより大きなリザーバーと平衡させます。最初、タンパク質溶液の液滴には比較的低い沈殿剤とタンパク質の濃度が含まれていますが、液滴とリザーバーが平衡化するにつれて、液滴内の沈殿剤とタンパク質の濃度が増加します。特定のタンパク質に適切な結晶化溶液を使用すると、液滴内で結晶の成長が起こります。^{[11] [12]}この方法は、タンパク質濃度と沈殿剤濃度の穏やかで段階的な変化を可能にし、大きく整然とした結晶の成長を助けるために使用されます。

蒸気拡散は、ハンギングドロップまたはシッティングドロップ形式で実行できます。ハンギングドロップ装置では、タンパク質溶液の滴を逆さまにしたカバーガラスの上に置き、それをリザーバーの上に吊り下げます。シッティングドロップ結晶化装置では、液滴をリザーバーから離れた台座の上に置きます。これらの方法の両方とも、液滴とリザーバーの間の平衡が起こるように環境を密閉する必要があります。^{[11] [13]}

マイクロバッチでは通常、非常に少量のタンパク質液滴をオイルに浸します (1 μL 程度)。オイルが必要な理由は、使用するタンパク質溶液の量が非常に少ないため、実験を水性で行うには蒸発を抑制する必要があるからです。使用できるオイルはさまざまですが、最も一般的な 2 つのシーリング剤はパラフィン オイル (Chayen らによる説明) とシリコン オイル (D'Arcy による説明) です。また、液体シーリング剤を使用せず、代わりに科学者がウェルに液滴を入れた後、ウェル付きプレートにフィルムまたはテープをすばやく配置するマイクロバッチング方法もあります。

この方法には、必要なサンプルの量が非常に限られていることに加え、実験中にサンプルが空気にさらされることがないため、空気中の汚染からサンプルが保護されるというさらなる利点もあります。

マイクロ透析は、小さな分子とイオンは通過できるが、タンパク質と大きなポリマーは通過できない半透膜を利用します。膜を横切る溶質濃度の勾配を確立し、システムを平衡に向かって進行させることにより、システムはゆっくりと過飽和に向かって移動することができ、その時点でタンパク質結晶が形成される可能性があります。

マイクロ透析は、タンパク質の溶解度を低下させる高濃度の塩または他の小さな膜透過性化合物を使用して塩析することで結晶を生成できます。ごくまれに、一部のタンパク質は、透析塩析、つまり純水に対して透析して溶質を除去し、自己会合と結晶化を促進することで結晶化できます。

この技術は、タンパク質と沈殿溶液を事前に混合せずに、チャネルの両側から注入して拡散による平衡状態を作り出す。2つの溶液は試薬チャンバー内で最大濃度で接触し、自発的な核形成を開始する。システムが平衡状態になると、過飽和度が低下し、結晶の成長が促進される。^[14]

タンパク質結晶化の基本的な原動力は、分子間相互作用を通じて別のタンパク質と形成できる結合の数を最適化することです。^{[3]これらの相互作用は、分子の電子密度と、} pHの関数として変化するタンパク質側鎖に依存します。^[10]タンパク質の三次構造と四次構造は、アミノ酸の側基間の分子間相互作用によって決定されます。この場合、親水基は通常、溶液の外側を向いており、溶媒（水）に対する水和殻を形成します。^[10] pH が変化すると、これらの極性側基の電荷も溶液の pH とタンパク質のpKaに応じて変化します。したがって、分子同士の結合が水分子との結合よりも好ましい結晶形成を促進するためには、 pH の選択が不可欠です。^[10] pH は、最適な結晶化条件に割り当てることができる最も強力な操作の1つです。

タンパク質の溶解度は温度の関数であるため、温度は議論すべきもう一つの興味深いパラメータです。^{[15]タンパク質結晶化では、結晶をうまく生成するために温度を操作することは一般的な戦略の1つです。pHとは異なり、緩衝液調製の温度、 [16]}実際の結晶化実験の温度など、 結晶学実験のさまざまなコンポーネントの温度が最終結果に影響を与える可能性があります。

化学添加物は、結晶化のプロセスに添加され、結晶の収量を増やす小さな化合物です。^[17]タンパク質結晶化における小分子の役割は、ほとんどの場合に汚染物質と考えられていたため、初期の頃は十分に考慮されていませんでした。^[17]小さな分子はタンパク質などの高分子よりも結晶化しやすいため、マクファーソンの研究以前は化学添加物の使用は制限されていました。しかし、これは結晶化の実験パラメータの強力な側面であり、生化学者や結晶学者がさらに調査して適用することが重要です。^[17]

結晶成長を成功させるために必要なさまざまな条件を調査するために必要な多数の実験を効率化するために、ハイスループット法が存在します。事前に組み立てられた成分をシステムに適用して、確実に結晶化を成功させる市販のキットが数多く注文可能です。このようなキットを使用すると、科学者はタンパク質を精製したり、適切な結晶化条件を決定したりする手間を省くことができます。^[18]

液体処理ロボットを使用すると、多数の結晶化実験を同時にセットアップして自動化できます。人間が行うと時間がかかり、エラーが発生しやすいプロセスも、自動化システムを使用すると効率的かつ正確に実行できます。ロボット結晶化システムは、上記と同じコンポーネントを使用しますが、手順の各ステップを迅速に、多数の反復で実行します。各実験では微量の溶液を使用しますが、サイズが小さいことの利点は2つあります。サンプルサイズが小さいと、精製タンパク質の消費量が削減されるだけでなく、溶液の量が少ないため結晶化が速くなります。各実験は、結晶の成長を検出するカメラによって監視されます。^[12]

^{タンパク質は、表面エントロピー低減[19]}や結晶接触の工学^[20]などの技術を使用することで、タンパク質結晶化の成功率を向上させるように設計することができます。 多くの場合、問題のあるシステイン残基は、ジスルフィド媒介凝集を避けるためにアラニンに置き換えられ、リジン、グルタミン酸、グルタミンなどの残基は、結晶化を妨げる可能性のある固有のタンパク質柔軟性を減らすためにアラニンに変更することができます。

タンパク質結晶からの高分子構造は、X線回折/ X線結晶構造解析、極低温電子顕微鏡法（CryoEM）（電子結晶構造解析および微結晶電子回折（MicroED）を含む）、小角X線散乱、中性子回折など、さまざまな方法を使用して決定できます。構造生物学も参照してください。

タンパク質の結晶化は、医薬品目的のタンパク質の配合にも有用である。^[21]

• このページは、A. Malcolm Campbell 博士の明示的な同意を得て (修正を加えて) 複製されました。2010 年現在、元のページは Campbell AM (2003)「Protein Crystallization」にあります。Davidson、NC: Davidson College、生物学部。