電圧クランプ

電圧クランプは、電気生理学者がニューロンなどの興奮性細胞の膜を通過するイオン 電流を測定し、膜電圧を一定レベルに保つために使用する実験方法です。 ^{[1]基本的な電圧クランプは、}膜電位を繰り返し測定し、必要な電流を追加することで膜電位 (電圧) を目的の値に変更します。これにより、細胞膜が目的の一定電圧に「クランプ」され、電圧クランプが供給される電流を記録できるようになります。細胞に適用される電流は、設定電圧で細胞膜を横切る電流と等しく (電荷が反対で) なければならないため、記録された電流は、細胞が膜電位の変化にどのように反応するかを示します。 ^[2]興奮性細胞の細胞膜には、さまざまな種類のイオンチャネルが含まれており、その一部は電圧依存性です。電圧クランプを使用すると、膜電圧をイオン電流とは独立して操作できるため、膜チャネルの電流と電圧の関係を研究できます。^[3]

電圧クランプの概念は、1947年春にケネス・コール^[4]とジョージ・マーモント^{[5]によって考案されました。 [6]彼らはイカの巨大な軸索に内部電極を挿入し、電流を流し始めました。コールは、2つの}電極とフィードバック回路を使用して、細胞の 膜電位を実験者が設定したレベルに 保つことが可能であることを発見しました。

コールは、微小電極の時代以前に電圧クランプ法を開発したため、彼の2つの電極は、絶縁棒の周りに巻かれた細いワイヤで構成されていました。このタイプの電極は最大の細胞にしか挿入できなかったため、初期の電気生理学実験は、ほとんどイカの軸索のみで行われました。

イカは捕食者から逃げるなど、素早く移動する必要があるときに水を噴射します。この逃走をできるだけ速くするために、イカは直径 1 mm に達する軸索を持っています(信号は大きな軸索ほど速く伝わります)。イカの巨大軸索は、膜貫通電流を電圧クランプするために使用できる最初の準備であり、ホジキンとハクスリーの活動電位の特性に関する先駆的な実験の基礎となりました。^[6]

アラン・ホジキンは、膜を横切るイオンの流れを理解するには、膜電位の差をなくす必要があることに気付きました。^[7]電圧クランプを使った実験により、ホジキンとアンドリュー・ハクスリーは、 1952年の夏に5本の論文を発表し、イオン電流がどのように活動電位を生じるかを解説しました。^[8]最後の論文では、活動電位を数学的に記述するホジキン・ハクスリーモデルが提案されました。活動電位を詳細に研究しモデル化するために実験で電圧クランプを使用したことは、電気生理学の基礎を築き、この功績により2人は1963年のノーベル生理学・医学賞を共同受賞しました。^[7]

電圧クランプは電流発生器です。膜間電圧は、接地を基準として「電圧電極」を通じて記録され、「電流電極」は細胞に電流を流します。実験者は「保持電圧」または「コマンド電位」を設定し、電圧クランプは負のフィードバックを使用して細胞をこの電圧に維持します。電極はアンプに接続され、膜電位を測定して信号をフィードバック アンプに送ります。このアンプは、コマンド電位を決定する信号発生器からの入力も受け取り、コマンド電位から膜電位を減算し (V_コマンド- V _m )、差を拡大して出力を電流電極に送信します。細胞が保持電圧から逸脱するたびに、オペアンプは「エラー信号」、つまりコマンド電位と細胞の実際の電圧の差を生成します。フィードバック回路は細胞に電流を流して、エラー信号をゼロにします。したがって、クランプ回路はイオン電流と等しく反対の電流を生成します。

2電極電圧クランプ（TEVC）法は、膜タンパク質、特にイオンチャネルの特性を研究するために使用されます。^{[9]研究者はこの方法を、}アフリカツメガエル 卵母細胞 で発現する膜構造を調べるために最もよく使用します。これらの卵母細胞はサイズが大きいため、取り扱いや操作が容易です。^[10]

TEVC法では、2つの低抵抗ピペットを使用します。1つは電圧を感知し、もう1つは電流を注入します。導電性溶液で満たされたマイクロ電極を細胞に挿入して、人工的に膜電位を制御します。膜は誘電体と抵抗器として機能し、膜の両側の流体はコンデンサーとして機能します。^[10]マイクロ電極は膜電位をコマンド電圧と比較し、膜を流れる電流を正確に再現します。電流の読み取り値は、さまざまなアプリケーションに対する細胞の電気的応答を分析するために使用できます。

この技術は、大電流を解像する必要がある場合、単一微小電極クランプや他の電圧クランプ技術よりも好まれます。2 電極クランプの高電流通過容量により、単一電極パッチ技術では制御できない大電流をクランプできます。^[11] 2 電極システムは、クランプの安定化時間が速く、ノイズが少ないという点でも優れています。ただし、TEVC は細胞サイズに関して使用が制限されています。直径の大きい卵母細胞には効果的ですが、小さな細胞で使用するのは困難です。さらに、TEVC 法は、電流の送信機をピペットに収める必要があるという点で制限があります。クランプ中に細胞内液を操作することはできませんが、パッチクランプ技術では可能です。^[2]もう 1 つの欠点は、「空間クランプ」の問題です。コールの電圧クランプでは、イカの軸索を全長にわたって均一にクランプする長いワイヤを使用しました。TEVC 微小電極は、不規則な形状の細胞のすべての部分に均一に影響を与えることができない 空間的な点電流源しか提供できません。

デュアルセル電圧クランプ法は、2電極電圧クランプ法の特殊なバリエーションであり、ギャップ結合チャネルの研究にのみ使用されます。^[12]ギャップ結合は、2つの細胞を直接リンクする細孔であり、イオンと小分子が自由に流れます。ギャップ結合タンパク質、通常はコネキシンまたはイネキシンが、内因的またはmRNAの注入によって発現されている2つの細胞の場合、細胞間に接合チャネルが形成されます。システムには2つの細胞が存在するため、2セットの電極が使用されます。記録電極と電流注入電極が各細胞に挿入され、各細胞は個別にクランプされます（各電極セットは別の装置に接続され、データの統合はコンピューターによって実行されます）。接合コンダクタンスを記録するために、最初のセルの電流が変化し、2番目のセルの記録電極は2番目のセルのV _mの変化のみを記録します。 （このプロセスは逆に、刺激が2番目の細胞で発生し、記録が1番目の細胞で発生するようにすることもできる。）記録された細胞では電極によって電流の変化は誘発されないため、電圧の変化は、電流が変化した細胞からギャップ結合チャネルを介して記録された細胞に流れる電流によって誘発される必要がある。^[12]

このカテゴリでは、1 つの電極を電圧クランプに使用する一連の技術について説明します。連続単一電極クランプ (SEVC-c) 技術は、パッチクランプ記録でよく使用されます。不連続単一電極電圧クランプ (SEVC-d) 技術は、浸透性細胞内記録で使用されます。この単一電極は、電流注入と電圧記録の両方の機能を実行します。

「パッチクランプ」技術により、個々のイオンチャネルを研究できます。この技術では、先端が比較的大きく (1 マイクロメートル以上)、表面が滑らか (鋭い先端ではない) な電極を使用します。これが「パッチクランプ電極」です (細胞を刺すのに使用する「鋭い電極」とは異なります)。この電極を細胞膜に押し当て、吸引力で細胞膜を電極先端内に引き込みます。吸引力により、細胞は電極としっかりと密着します (抵抗が 1ギガオームを超えるため、「ギガオーム シール」と呼ばれます)。

SEV-c の利点は、2 つの電極で刺入することが不可能な小さな細胞から記録できることです。ただし、

1. マイクロ電極は不完全な導体で、一般に抵抗は 100 万オームを超えます。マイクロ電極は整流性 (つまり、電圧に応じて抵抗が不規則に変化すること) があり、細胞の内容物によって詰まると抵抗が不安定になることがあります。そのため、特に急速に変化している細胞電圧を正確に記録できず、電流も正確に流せません。
2. 電圧および電流のエラー: SEV-c 回路は、クランプされている細胞の電圧を実際には測定しません (2 電極クランプのように)。パッチ クランプ アンプは 2 電極クランプに似ていますが、電圧測定回路と電流通過回路が接続されている点が異なります (2 電極クランプでは、これらは細胞を介して接続されます)。電極は、アンプ内の電流/電圧ループに接触するワイヤに接続されています。したがって、電極はフィードバック回路に間接的な影響しか与えません。アンプは電極上部の電圧のみを読み取り、補正のために電流をフィードバックします。ただし、電極が不完全な導体である場合、クランプ回路は膜電位を歪んで表示します。同様に、回路がその (歪んだ) 電圧を補正するために電流を戻すと、電流は細胞に到達する前に電極によって歪んでしまいます。これを補うために、電気生理学者は可能な限り抵抗の低い電極を使用し、実験中に電極の特性が変化しないようにし (誤差が一定になるように)、クランプが正確に追従できないほど速度が速すぎる可能性のある電流の記録を避けます。クランプしようとする電圧の変化が遅く小さいほど、SEV-c の精度は上がります。
3. 直列抵抗誤差: セルに流れる電流は、回路を完成させるためにグランドに流れなければなりません。電圧は、グランドを基準としてアンプによって記録されます。セルが自然な静止電位でクランプされている場合、問題はありません。クランプは電流を流しておらず、電圧はセルによってのみ生成されています。しかし、異なる電位でクランプする場合、直列抵抗誤差が問題になります。セルは、自然な静止電位に戻ろうと、膜に電流を流します。クランプ アンプは、保持電位を維持するために電流を流すことでこれに対抗します。問題が発生するのは、アンプとセルの間に電極があるためです。つまり、電極はセルの膜である抵抗器と直列になっています。したがって、電極とセルに電流を流すと、オームの法則により、セルと電極の両方の抵抗に電圧が発生します。これらの抵抗器は直列になっているため、電圧降下が加わります。電極と細胞膜の抵抗が等しく (通常は等しくありません)、実験者が静止電位から 40mV の変化を指示すると、増幅器は 40mV の変化が達成されたと読み取るまで十分な電流を流します。ただし、この例では、電圧降下の半分は電極で発生します。実験者は細胞電圧を 40mV 変化させたと考えますが、実際には 20mV しか変化していません。この差が「直列抵抗誤差」です。最新のパッチクランプ増幅器にはこの誤差を補正する回路がありますが、補正できるのは誤差の 70～80% だけです。電気生理学者は、細胞の自然な静止電位またはその近くで記録し、できるだけ抵抗の低い電極を使用することで、誤差をさらに減らすことができます。
4. 静電容量の誤差。マイクロ電極はコンデンサであり、非線形であるため特に厄介です。静電容量は、電極内部の電解質が絶縁体 (ガラス) によって外部の溶液から分離されているために発生します。これは、定義と機能上、コンデンサです。さらに悪いことに、先端から遠ざかるほどガラスの厚さが変化するため、コンデンサの時定数が変わります。これにより、膜電圧または電流が変化するたびに、歪んだ記録が生成されます。アンプはこれを補正できますが、静電容量には多くの時定数があるため、完全に補正することはできません。実験者は、セルの浸漬溶液を浅く保ち (液体にさらされるガラス表面を少なくする)、内部溶液と外部溶液の間の距離を広げるシリコン、樹脂、塗料、またはその他の物質で電極をコーティングすることで、問題を軽減できます。
5. 空間クランプ エラー。単一の電極は電流の点源です。細胞の離れた部分では、電極を通過する電流の影響は、細胞の近くの部分よりも小さくなります。これは、複雑な樹状構造を持つニューロンから記録する場合に特に問題になります。実験の結論を和らげる以外に、空間クランプ エラーに対してできることは何もありません。

単一電極電圧クランプ (不連続)、つまり SEVC-d は、細胞全体の記録において SEVC-c よりもいくつかの利点があります。この場合、電流を流して電圧を記録するための異なるアプローチが採用されます。SEVC-d アンプは「時分割」方式で動作するため、電極は電流を流すことと電圧を測定することを定期的かつ頻繁に切り替えます。実際には 2 つの電極がありますが、それぞれがオンになっている時間の半分だけ動作します。単一電極の 2 つの機能間の振動は、デューティ サイクルと呼ばれます。各サイクル中、アンプは膜電位を測定し、それを保持電位と比較します。オペアンプは差を測定し、エラー信号を生成します。この電流は、細胞によって生成された電流のミラー イメージです。アンプの出力にはサンプル アンドホールド回路が備わっているため、短時間サンプリングされた各電圧は、次のサイクルで次の測定が行われるまで出力に保持されます。具体的には、アンプはサイクルの最初の数マイクロ秒で電圧を測定し、エラー信号を生成し、サイクルの残りの時間は電流を流してそのエラーを減らします。次のサイクルの開始時に、電圧が再び測定され、新しいエラー信号が生成され、電流が流れるなどします。実験者はサイクルの長さを設定し、67 kHz のスイッチング周波数に対応する約 15 マイクロ秒という短い周期でサンプリングすることが可能です。約 10 kHz 未満のスイッチング周波数では、1 ミリ秒未満の幅の活動電位を扱う場合、十分ではありません。すべての不連続電圧クランプ増幅器が 10 kHz を超えるスイッチング周波数をサポートしているわけではないことに注意してください。^[10]

これが機能するには、セルの静電容量が電極の静電容量より少なくとも 1桁高くなければなりません。静電容量は電流の運動 (上昇時間と下降時間) を遅くします。電極の静電容量がセルの静電容量よりはるかに小さい場合、電流が電極を通過すると、電極電圧はセル電圧よりも速く変化します。したがって、電流が注入されてからオフにされると (デューティ サイクルの終了時)、電極電圧はセル電圧よりも速く低下します。電極電圧がセル電圧に漸近するとすぐに、電圧を (再び) サンプリングして次の量の電荷を適用できます。したがって、デューティ サイクルの周波数は、電流を流している間に電極電圧が上昇および低下する速度に制限されます。電極の静電容量が低いほど、サイクルを速くすることができます。

SEVC-d は、実験者が膜電位を測定できる点で SEVC-c より大きく優れています。また、電流を流しながら電圧を測定する必要がないため、直列抵抗エラーが発生することはありません。主な欠点は、時間分解能が制限され、増幅器が不安定なことです。電流が多すぎて目標電圧を超えてしまうと、次のデューティ サイクルで電流の極性が反転します。これにより目標電圧を下回るため、次のサイクルでは注入電流の極性が再び反転します。このエラーはサイクルごとに大きくなり、最終的には増幅器が制御不能に振動 (「リンギング」) します。これにより、通常、記録されている細胞が破壊されます。研究者は、時間分解能を向上させるためにデューティ サイクルを短くしたいと考えています。アンプには調整可能な補償器があり、電極電圧の減衰を早めますが、これを高く設定しすぎるとアンプが鳴ります。そのため、調査員は常にアンプを制御不能な振動の限界にできるだけ近づけるように「調整」しようとします。この場合、録音条件の小さな変化が鳴り響く原因となります。解決策は 2 つあります。アンプの設定を安全な範囲に「戻す」か、アンプが鳴り始める兆候に注意することです。

制御理論の観点からは、電圧クランプ実験は、高ゲイン出力フィードバック制御則^[13]を神経膜に適用することで説明できる。^[14]数学的には、膜電圧は、印加電流によって与えられる入力と膜電圧によって与えられる出力を持つコンダクタンスベースのモデルによってモデル化できる。ナトリウムイオン電流とカリウムイオン電流、およびリーク電流を含む神経膜を表すホジキンとハクスリーのオリジナルのコンダクタンスベースのモデルは、常微分方程式のシステムで与えられる。${\displaystyle I_{app}(t)}$${\displaystyle V(t)}$

${\displaystyle C_{m}{\frac {dV}{dt}}=-{\bar {g}}_{\text{K}}n^{4}(V-V_{\text{K}})-{\bar {g}}_{\text{Na}}m^{3}h(V-V_{\text{Na}})-{\bar {g}}_{\text{L}}(V-V_{L})+I_{app}}$

${\displaystyle {\frac {dp}{dt}}=\alpha _{p}(V)(1-p)-\beta _{p}(V)p,\quad p=m,n,h}$

ここで、は膜容量、およびは最大コンダクタンス、、およびは逆転電位、およびはイオンチャネルの電圧依存速度定数、状態変数、、 および はイオンチャネルのゲーティング変数です。 ${\displaystyle C_{m}}$${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{Na}}}$${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{K}}}$${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{L}}}$${\displaystyle V_{\text{Na}}}$${\displaystyle V_{\text{K}}}$${\displaystyle V_{\text{L}}}$${\displaystyle \alpha _{p}}$${\displaystyle \beta _{p}}$${\displaystyle m}$${\displaystyle h}$${\displaystyle n}$

フィードバック法則が厳密に証明できる。

${\displaystyle I_{app}(t)=k(V_{\text{ref}}-V(t))}$

ゲインが任意の大きな値に増加すると、膜電圧は基準電圧に任意に近づく。 ^[14]この事実は、動的システムの一般的な特性ではない（一般に、高ゲインは不安定性につながる可能性がある^[15] ）が、上記のコンダクタンスベースのモデルの構造と特性の結果である。特に、によって駆動される各ゲート変数のダイナミクスは、指数関数的収縮の強い安定性特性を検証する。^{[14] [16]}${\displaystyle V(t)}$${\displaystyle V_{\text{ref}}}$${\displaystyle k>0}$${\displaystyle p=m,h,n}$${\displaystyle V}$

• Sherman-Gold R 編 (1993)。「生体電気」(PDF)。電気生理学および生物物理学実験技術のための Axon ガイド。Axon Instruments。pp. 1–16。OCLC 248830666  。