顕微鏡

顕微鏡

用途	小規模サンプル観察
注目すべき実験	細胞の発見
関連商品	光学顕微鏡、電子顕微鏡

顕微鏡（古代ギリシャ語のμικρός ( mikrós )  「小さい​​」とσκοπέω ( skopéō )  「見る、調べる、検査する」に由来）は、肉眼では見えないほど小さい物体を検査するために使用される実験器具です。顕微鏡検査は、顕微鏡を使用して小さな物体や構造を調査する科学です。顕微鏡的とは、顕微鏡を使わないと目に見えないことを意味します。

顕微鏡には多くの種類があり、さまざまな方法で分類することができます。1つの方法は、機器がサンプルと相互作用して画像を生成する方法を説明することです。光路にあるサンプルに光線または電子を送るか、サンプルからの光子放出を検出するか、プローブを使用してサンプルの表面を横切って短い距離をスキャンするかのいずれかです。最も一般的な顕微鏡（そして最初に発明された顕微鏡）は光学顕微鏡で、レンズを使用して薄く切ったサンプルを通過した可視光を屈折させ、観察可能な画像を生成します。その他の主要な顕微鏡の種類には、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡（透過型電子顕微鏡と走査型電子顕微鏡の両方）、およびさまざまなタイプの走査型プローブ顕微鏡があります。^[1]

レンズに似た物体は4000年前から存在し、水を満たした球体の光学特性に関するギリシャの記述（紀元前5世紀）があり、その後何世紀にもわたって光学に関する著作が残されていますが、単純な顕微鏡（虫眼鏡）の使用例として最も古いものは、 13世紀に眼鏡のレンズが広く使われ始めた頃に遡ります。 ^{[2] [3] [4]}標本の近くにある対物レンズと接眼レンズを組み合わせて実像を観察する複合顕微鏡の最も古い例は、1620年頃にヨーロッパで登場しました。^[5]長年にわたって多くの主張がなされていますが、発明者は不明です。いくつかはネーデルラントの眼鏡製造の中心地にまつわるものであり、1590年にザカリアス・ヤンセン（その息子による主張）やザカリアスの父ハンス・マルテンス、あるいはその両方によって発明されたとする主張がある。^{[6] [7]}隣人でありライバル関係にあった眼鏡製造者のハンス・リッペルスハイ（1608年に最初の望遠鏡の特許を申請）によって発明されたとする主張がある^。[8]そして、 1619年にロンドンにそのバージョンがあったことが記録されている外国人 コルネリス・ドレベルによって発明されたとする主張がある。 ^{[9] [10]} ガリレオ・ガリレイ（複合顕微鏡の発明者としても引用される）は、1610年以降、小さな対象物を観察するために望遠鏡を近づけて焦点を合わせることができることに気づいたようで、1624年にローマで展示されたドレベルの複合顕微鏡を見た後、独自の改良版を製作した。^{[11] [12] [13]} ジョヴァンニ・ファーベルは、ガリレオが1625年にリンチェイ美術アカデミーに提出した複合顕微鏡に「顕微鏡」という名前をつけました^[14]（ガリレオはそれを「小さな目」を意味するオッキオリーノと呼んでいました）。ルネ・デカルト（『視力学』 1637年）は、物体に向かって凹面になっている凹面鏡とレンズを組み合わせて物体を照らし、その物体を鏡の焦点に固定する点に設置する顕微鏡について説明しています。^[15]

顕微鏡を用いた有機組織の微視的解剖学に関する最初の詳細な記述は、1644年にジャンバッティスタ・オディエルナの『蠅の目』に初めて登場した。^[16]

顕微鏡は、1660年代から1670年代にかけてイタリア、オランダ、イギリスの博物学者が生物学の研究に使い始めるまで、まだほとんど目新しいものに過ぎなかった。生物学史家の一部から組織学の父と呼ばれているイタリアの科学者マルチェロ・マルピーギは、肺から生物学的構造の分析を始めた。1665年に出版されたロバート・フックの『顕微鏡図鑑』は、主にその印象的な挿絵のせいで大きな影響を与えた。フックは、紡いだガラス糸の端を溶かして作った小さなガラス球で、小さなレンズを作った。^[15]重要な貢献をしたのが、シンプルな単レンズ顕微鏡を使用して300倍までの倍率を達成したアントニー・ファン・レーウェンフックだった。彼は、非常に小さなガラス球レンズを、リベットで留めた2枚の金属板の穴の間に挟み、ネジで調整できる針を使って標本を固定した。^{[17]その後、レーウェンフックは}赤血球（ヤン・スワンメルダムに倣って）と精子を再発見し、生物学的超微細構造を観察するための顕微鏡の使用を普及させるのに貢献した。1676年10月9日、レーウェンフックは微生物の発見を報告した。^[16]

複合光学顕微鏡の性能は、標本に光の焦点を合わせるコンデンサーレンズシステムと、標本からの光を捉えて画像を形成する対物レンズの品質と正しい使用に依存します。^[5] 19世紀後半から20世紀初頭にかけてこの原理が完全に認識され、発展し、電球が光源として利用できるようになるまでは、初期の機器には限界がありました。1893年、オーガスト・ケーラーは、光学顕微鏡の解像度の理論上の限界を達成する上で中心的な役割を果たす、標本照明の重要な原理であるケーラー照明を開発しました。この標本照明方法は、均一な照明を生み出し、初期の標本照明技術によって課せられたコントラストと解像度の限界を克服しました。標本照明のさらなる発展は、1953年のフリッツ・ゼルニケによる位相コントラストの発見と1955年のジョルジュ・ノマルスキーによる微分干渉コントラスト照明の発見に由来します。

20 世紀初頭、光学顕微鏡に代わる重要な装置が開発されました。これは、光ではなく電子ビームを使用して画像を生成する装置です。ドイツの物理学者エルンスト・ルスカは、電気技師マックス・ノールと共同で、1931 年に最初のプロトタイプの電子顕微鏡である透過型電子顕微鏡(TEM) を開発しました。透過型電子顕微鏡は、光学顕微鏡と同様の原理で動作しますが、光の代わりに電子を使用し、ガラス レンズの代わりに電磁石を使用します。光の代わりに電子を使用すると、解像度が大幅に向上します。

透過型電子顕微鏡の開発に続いて、1935年にはマックス・ノールが走査型電子顕微鏡を開発しました。^[18] TEMは第二次世界大戦前から研究に使用されており、戦後も普及しましたが、SEMは1965年まで市販されていませんでした。

透過型電子顕微鏡は第二次世界大戦後に普及しました。シーメンスに勤務していたエルンスト・ルスカが最初の商用透過型電子顕微鏡を開発し、1950 年代には電子顕微鏡に関する主要な科学会議が開催され始めました。1965 年、最初の商用走査型電子顕微鏡がチャールズ・オートリー教授と大学院生のゲイリー・スチュワートによって開発され、ケンブリッジ インストゥルメント社によって「ステレオスキャン」として販売されました。

電子顕微鏡の使用に関する最新の発見の1つは、ウイルスを識別する能力です。^[19]この顕微鏡は小さな細胞小器官の目に見える鮮明な画像を生成するため、電子顕微鏡ではウイルスや有害な細胞を見るために試薬を必要とせず、病原体を検出するより効率的な方法になります。

1981年から1983年まで、ゲルト・ビニッヒとハインリッヒ・ローラーは、スイスのチューリッヒにあるIBMで量子トンネル現象を研究した。彼らは量子トンネル理論に基づいて、プローブとサンプル表面の間で交換される非常に小さな力を読み取る実用的な機器、走査型プローブ顕微鏡を作成した。プローブは表面に非常に接近するため、電子はプローブとサンプルの間を連続的に流れ、表面からプローブへ電流が流れる。この顕微鏡は、基礎となる理論的説明が複雑であったため、当初はあまり受け入れられなかった。1984年、ニュージャージー州マレーヒルにあるAT&Tのベル研究所にいたジェリー・ターゾフとD.R.ハーマンは、理論と機器で得られた実験結果を結び付けた記事を発表し始めた。これに続いて1985年には実際に機能する商用機器が発表され、1986年にはゲルト・ビニッヒ、クエイト、ガーバーが原子間力顕微鏡を発明^[20]

極細プローブやチップの加工能力の向上に伴い、新しいタイプの走査型プローブ顕微鏡が開発され続けています。

光学顕微鏡の最近の発展は、主に生物学における蛍光顕微鏡の台頭に集中しています。^[21] 20世紀最後の数十年間、特にポストゲノム時代には、細胞構造の蛍光染色のための多くの技術が開発されました。^[21]主な技術グループには、特定の細胞構造を標的とした化学染色、たとえばDNAを標識するための化学化合物DAPI、蛍光レポーターと結合した抗体の使用（ 免疫蛍光を参照）、および緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質の使用が含まれます。^[22]これらの技術は、生きたサンプルと固定サンプルの両方で、分子レベルでの細胞構造の分析にこれらのさまざまな蛍光体を使用します。

蛍光顕微鏡の台頭により、現代の主要な顕微鏡設計である共焦点顕微鏡の開発が促進されました。この原理は 1957 年にマービン ミンスキーによって特許取得されましたが、レーザー技術によってこの技術の実用化は制限されていました。トーマスとクリストフ クレマーが最初の実用的な共焦点レーザー走査顕微鏡を開発したのは 1978 年になってからで、この技術は 1980 年代を通じて急速に普及しました。

光学顕微鏡技術に関する現在の研究（21世紀初頭）の多くは、蛍光標識サンプルの超解像分析の開発に焦点を当てています。構造化照明は解像度を約2〜4倍向上させることができ、誘導放出抑制（STED）顕微鏡法などの技術は電子顕微鏡の解像度に近づいています。^[23]これは、回折限界が光または励起によって発生するためであり、解像度を2倍にしないと超飽和にならないためです。ステファン・ヘルは、蛍光顕微鏡法を単一分子の可視化に応用したエリック・ベッツィグとウィリアム・モーナーとともに、STED技術の開発により2014年のノーベル化学賞を受賞しました。^[24]

X線顕微鏡は、通常軟X線帯域の電磁放射線を使用して物体を画像化する機器です。1970年代初頭のX線レンズ光学系の技術的進歩により、この機器は画像化の現実的な選択肢となりました。^[25]これらは、化学的に固定されていない生物学的材料を含む物体の3次元画像を生成するために、断層撮影（マイクロコンピュータ断層撮影を参照）でよく使用されます。現在、より透過力の高い硬X線用の光学系を改良する研究が行われています。^[25]

顕微鏡はいくつかのクラスに分けられます。1 つのグループは、画像を生成するためにサンプルと相互作用するもの、つまり光または光子(光学顕微鏡)、電子(電子顕微鏡)、またはプローブ (走査型プローブ顕微鏡) に基づいています。また、顕微鏡は、走査点を介してサンプルを分析するか (共焦点光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡)、またはサンプルを一度に分析するか (広視野光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡) に基づいて分類することもできます。

広視野光学顕微鏡と透過型電子顕微鏡はどちらもレンズ理論（光学顕微鏡の場合は光学系、電子顕微鏡の場合は電磁レンズ）を利用して、サンプルを透過した波やサンプルで反射した波の通過によって生成された画像を拡大します。使用される波は電磁波（光学顕微鏡の場合）または電子線（電子顕微鏡の場合）です。これらの顕微鏡の解像度はサンプルの画像化に使用される放射線の波長によって制限され、波長が短いほど解像度が高くなります。^[21]

共焦点顕微鏡や走査型電子顕微鏡などの走査型光学顕微鏡や走査型電子顕微鏡は、レンズを使用して光または電子のスポットをサンプルに焦点を合わせ、サンプルと相互作用するビームによって生成された信号を分析します。次に、そのポイントをサンプル上でスキャンして、長方形の領域を分析します。画像の拡大は、物理的に小さなサンプル領域をスキャンして得たデータを比較的大きな画面に表示することで実現します。これらの顕微鏡の解像度の限界は、広視野光学顕微鏡、プローブ顕微鏡、電子顕微鏡と同じです。

走査型プローブ顕微鏡も、サンプル内の 1 点を分析し、次にサンプルの長方形領域上でプローブをスキャンして画像を作成します。これらの顕微鏡は、画像化に電磁放射線や電子放射線を使用しないため、上記の光学顕微鏡や電子顕微鏡と同じ解像度の制限を受けません。

最も一般的なタイプの顕微鏡（そして最初に発明されたタイプ）は、光学顕微鏡です。これは、焦点面に置かれたサンプルの拡大画像を生成する1つ以上のレンズを備えた光学 機器です。光学顕微鏡には屈折ガラス（プラスチックや石英の場合もあります）があり、光を目や他の光検出器に焦点を合わせます。ミラーベースの光学顕微鏡も同様に動作します。可視光範囲を想定すると、光学顕微鏡の一般的な倍率は最大1,250倍で、理論上の解像度の限界は約0.250 マイクロメートルまたは250 ナノメートルです。^[21]これにより、実用的な倍率は約1,500倍に制限されます。特殊な技術（走査型共焦点顕微鏡、Vertico SMIなど）ではこの倍率を超える場合がありますが、解像度は回折限界です。紫外線などのより短い波長の光を使用することは、近接場走査型光学顕微鏡などのデバイスと同様に、光学顕微鏡の空間分解能を向上させる1つの方法です。

Sarfusは、標準的な光学顕微鏡の感度を高めて、ナノメートル フィルム (最小 0.3 ナノメートル) や孤立したナノ物体 (最小 2 ナノメートル直径) を直接視覚化できるレベルまで高めた最新の光学技術です。この技術は、交差偏光反射光顕微鏡法用の非反射基板の使用に基づいています。

紫外線は、顕微鏡的特徴の解像と、目には見えないサンプルの画像化を可能にします。近赤外線は、シリコンがこの波長領域で透明であるため、結合されたシリコンデバイスに埋め込まれた回路を視覚化するために使用できます。

蛍光顕微鏡 では、紫外線から可視光線までの多くの波長の光を使用してサンプルを蛍光させ、肉眼または特に感度の高いカメラで観察することができます。

位相差顕微鏡法は、透明な標本を通過する光の小さな位相シフトを画像の振幅またはコントラストの変化に変換する光学顕微鏡照明技術です。 ^{[21]位相差を使用すると、スライドを観察するために}染色する必要がありません。この顕微鏡技術により、生きた細胞の細胞周期を研究することが可能になりました。

従来の光学顕微鏡は、最近ではデジタル顕微鏡へと進化しました。接眼レンズを通して対象物を直接見るのに加えて、またはその代わりに、デジタルカメラで使用されるセンサーと同様のタイプのセンサーを使用して画像を取得し、それをコンピューターのモニターに表示します。これらのセンサーは、アプリケーションに応じて、 CMOSまたは電荷結合素子(CCD) 技術を使用します。

敏感な光子計数デジタルカメラを使用すれば、傷つきやすい生物サンプルへのダメージを避けるために、非常に低い光レベルでデジタル顕微鏡検査を行うことができる。エンタングルされた光子のペアを提供する光源は、最も光に敏感なサンプルへのダメージのリスクを最小限に抑えることができることが実証されている。ゴーストイメージングを光子スパース顕微鏡に応用すると、サンプルは赤外線光子で照らされ、各光子は可視帯域のエンタングルされたパートナーと空間的に相関し、光子計数カメラによる効率的な画像化が可能になる。^[27]

電子顕微鏡には、透過型電子顕微鏡（TEM）と走査型電子顕微鏡（SEM）の2つの主要な種類があります。 ^{[21] [22]}どちらも、高エネルギーの電子ビームをサンプルに集中させるための一連の電磁レンズと静電レンズを備えています。 TEMでは、基本的な光学顕微鏡と同様に、電子はサンプルを通過します。^[21]電子はほとんどの材料によって強く散乱されるため、注意深いサンプル準備が必要です。^[22]電子が通過できるようにするには、サンプルを非常に薄く（100 nm未満）する必要があります。^{[21] [22]}オスミウムと重金属で染色した細胞の断面には、リボソームなどの細胞小器官の膜とタンパク質が明確に示されています。^[22] 0.1 nmレベルの解像度では、ウイルス（20〜300 nm）とDNA鎖（幅2 nm）の詳細な画像を取得できます。^[22]対照的に、SEMにはラスターコイルがあり、細い電子ビームでバルク物体の表面をスキャンします。そのため、試料を必ずしも切断する必要はありませんが、非導電性のサンプルの場合はナノメートルの金属または炭素層でコーティングする必要がある場合があります。^[21] SEMは、乾燥を防ぐために薄い水蒸気中でサンプルの表面を高速に画像化することができます。^{[21] [22]}

走査型プローブ顕微鏡のさまざまなタイプは、小さなプローブが試料上を走査し、試料と相互作用するときに発生するさまざまなタイプの相互作用から生じます。これらの相互作用またはモードは、表面上の位置の関数として記録またはマッピングされ、特性マップを形成できます。走査型プローブ顕微鏡の最も一般的な 3 つのタイプは、原子間力顕微鏡(AFM)、近接場走査型光学顕微鏡(NSOM または SNOM、走査型近接場光学顕微鏡)、および走査型トンネル顕微鏡(STM) です。^[28]原子間力顕微鏡には、通常シリコンまたはシリコン窒化物でできた細いプローブがカンチレバーに取り付けられています。プローブはサンプルの表面上で走査され、プローブとサンプルの表面との相互作用を引き起こす力が測定され、マッピングされます。近接場走査型光学顕微鏡は AFM に似ていますが、そのプローブは、通常、光が通過するための開口部がある先端で覆われた光ファイバー内の光源で構成されています。顕微鏡は透過光または反射光をキャプチャして、通常は生物標本の表面の非常に局所的な光学特性を測定できます。走査型トンネル顕微鏡には、先端に単一の原子を持つ金属の先端があり、先端は電流が流れる管に取り付けられています。^[29]先端は、トンネル電流が流れるまで導電性サンプルの表面上で走査されます。電流はコンピューターによる先端の動きによって一定に保たれ、記録された先端の動きによって画像が形成されます。^[28]

走査型音響顕微鏡は、音波を利用して音響インピーダンスの変化を測定する。原理的にはソナーに似ており、集積回路に見られるものを含む材料の表面下の欠陥を検出するなどの用途に用いられる。2013年2月4日、オーストラリアのエンジニアは比類のない精度を提供する「量子顕微鏡」を開発した。^[30]

モバイル アプリ顕微鏡は、フラッシュライトを点灯するとオプションで光学顕微鏡として使用できます。ただし、モバイル アプリ 顕微鏡は、視覚的なノイズ、40 倍に制限されることが多いこと、およびカメラ レンズ自体の解像度の限界により、使いにくくなっています。

ウィキメディア・コモンズには、顕微鏡に関連するメディアがあります。

• 光学顕微鏡のマイルストーン、ネイチャー出版
• 光学顕微鏡に関する FAQ (2009 年 4 月 4 日アーカイブ)
• Nikon MicroscopyU、Nikon のチュートリアル
• 分子表現：光学と顕微鏡の世界を探る、フロリダ州立大学。