多焦点平面顕微鏡

多焦点面顕微鏡法（MUM ）は、マルチプレーン顕微鏡法またはマルチフォーカス顕微鏡法とも呼ばれ、標本内の異なる焦点面を同時に画像化することにより、生細胞の3Dダイナミクスを高い時間的および空間的解像度で追跡できる光学顕微鏡法の一種です。 ^{[1] [2] [3] [4]この方法では、無限遠補正}対物レンズによってサンプルから集められた光が2つの経路に分割されます。^[5]各経路で、分割された光は、チューブレンズから特定の較正距離に配置された検出器に焦点を合わせます。このようにして、各検出器はサンプル内の異なる平面を画像化します。最初に開発されたMUMセットアップは、サンプル内の2つの異なる平面を画像化できました。ただし、各光路で光をさらに分割し、特定の較正距離に配置された検出器に焦点を合わせることで、3つ以上の平面を画像化するようにセットアップを変更できます。^{[6] [7]}より多くの焦点面を画像化するために、画像分割光学系に基づくより単純な技術が開発されている。1つの例は、カスタマイズされた画像分割プリズムを使用することで、2台のカメラのみを使用して最大8つの焦点面を撮影することができる。^[8]さらに良いことに、標準的な市販の部分ビームスプリッターを使用して、いわゆるZスプリッタープリズムを構築することができ、1台のカメラを使用して9つの個別の焦点面を同時に画像化することができる。^{[9] [10]}マルチフォーカス顕微鏡法（MFM）と呼ばれる別の技術は、回折フーリエ光学系を使用して最大25の焦点面を画像化する。^{[11] [12]}

生細胞の蛍光顕微鏡検査は、輸送イベントの研究において主要なツールとなります。従来の顕微鏡設計は、2 次元、つまり焦点面での高速細胞動態を画像化するのに適しています。しかし、細胞は 3 次元の物体であり、細胞内輸送経路は通常、1 つの焦点面に制限されません。動態が 1 つの焦点面に制限されない場合、従来の単面顕微鏡技術は、3 次元での高速細胞内動態の詳細な研究には不十分です。焦点面の変更に基づく従来のアプローチは、焦点合わせ装置が多くの細胞内動態に比べて比較的遅いため、このような状況では効果的ではないことがよくあります。さらに、焦点面が間違った場所に間違った時間にある場合が多く、動的イベントの重要な側面を見逃す可能性があります。

MUMは、標準的な光学顕微鏡に実装できます。Zeiss顕微鏡での実装例は次のとおりです。^[13]まず、ZeissデュアルビデオアダプタをZeiss Axiovert 200顕微鏡のサイドポートに取り付けます。次に、2つのZeissデュアルビデオアダプタをそれぞれ最初のZeissビデオアダプタの出力ポートに取り付けて連結します。連結された各ビデオアダプタには、Cマウント/スペーサーリングとカスタム機械加工されたカメラカップリングアダプタを使用して、高解像度CCDカメラが取り付けられます。ビデオアダプタの出力ポートとカメラの間隔はカメラごとに異なるため、カメラは異なる焦点面を撮影します。

MUM を実装する方法は数多くあることに言及する価値があります。前述の実装には、柔軟性、設置とメンテナンスの容易さ、さまざまな構成への調整可能性など、いくつかの利点があります。さらに、多くのアプリケーションでは、異なる露出時間で異なる色の画像を取得できることが重要です。たとえば、TIRFMでエキソサイトーシスを視覚化するには、非常に高速な取得が必要です。ただし、細胞内の蛍光標識された静止した細胞小器官を画像化するには、光退色を避けるために低励起が必要であり、結果として取得は比較的遅くなければなりません。^[14]この点、上記の実装では、異なるカメラを使用して異なるチャネルで画像を取得できるため、大きな柔軟性が得られます。

現代の顕微鏡技術により、単一分子レベルでの細胞プロセスの研究に大きな関心が集まっています。単一分子実験では平均化効果が克服されるため、従来のバルク研究では得られない情報が得られます。しかし、単一分子の 3D 位置特定と追跡にはいくつかの課題があります。単一分子が潜在的に非常に複雑な 3D ダイナミクスを受けている間にその画像をキャプチャできるかどうかに加えて、単一分子の 3D 位置を特定できるかどうか、またそれをどの程度正確に実行できるかという疑問が生じます。

高精度の3D位置推定における大きな障害は、標準的な顕微鏡の深度識別能力の低さです。^[15]従来の顕微鏡では、高開口数の対物レンズを使用しても、点光源を焦点位置から数百ナノメートル移動させても、点光源の画像はほとんど変化しません。このため、従来の顕微鏡では、点光源の軸方向、つまりZ位置を特定することが非常に困難です。

より一般的には、3Dサンプルの定量的単分子顕微鏡法は、アプリケーションが位置特定/追跡であるか、3Dアプリケーション用のPALM、STORM、FPALM、dSTORMなどの超解像顕微鏡法であるかにかかわらず、つまり3次元での単一分子の位置の決定であるかどうかにかかわらず、同じ問題を引き起こします。 ^[16] MUMにはいくつかの利点があります。^[17] MUMでは、点光源の画像が異なる焦点レベルで同時に取得されます。これらの画像は、点光源のz位置を制限するために使用できる追加情報を提供します。この制限情報により、焦点付近の深度識別の問題が大幅に克服されます。

3D 位置特定尺度は、点光源の位置をどれだけ正確に特定できるかを定量的に測定します。3D 位置特定尺度の数値が小さいと、位置特定精度が非常に高いことを意味し、3D 位置特定尺度の数値が大きいと、位置特定精度が非常に低いことを意味します。従来の顕微鏡では、点光源が焦点面に近い場合 (例: z0 <= 250 nm)、3D 位置特定尺度は z 位置の推定精度が非常に低いと予測します。したがって、従来の顕微鏡では、点光源が焦点面に近い場合に 3D トラッキングを実行するのは困難です。

一方、2 平面 MUM セットアップの場合、3D 位置特定測定は、特に点光源が焦点面に近い場合に、さまざまな z 値に対して従来の顕微鏡よりも一貫して優れた精度を予測します。この結果からすぐにわかるのは、点光源の z 位置はさまざまな z 値に対して比較的同じレベルの精度で決定できることであり、これは 3D単一粒子追跡に適しています。

単一粒子イメージングアプリケーションでは、蛍光ラベルから検出された光子の数が、取得したデータの定量分析において重要な役割を果たします。現在、粒子追跡実験は、通常、倒立顕微鏡または正立顕微鏡で実行され、単一の対物レンズがサンプルを照らし、サンプルからの蛍光信号を収集します。サンプルからの蛍光放出はすべての方向（つまり、サンプルの上下）で発生しますが、これらの顕微鏡構成で単一の対物レンズを使用すると、サンプルの片側からの光しか収集されないことに注意してください。高開口数の対物レンズを使用した場合でも、対物レンズの収集角度が限られているため、サンプルの片側で放出されたすべての光子を収集することはできません。したがって、最良のイメージング条件であっても、従来の顕微鏡ではサンプルから放出された光子のほんの一部しか収集されません。

この問題を解決するために、2つの対物レンズを使用し、一方の対物レンズを反転させ、もう一方の対物レンズを垂直にした顕微鏡構成を使用することができます。この構成は、デュアル対物レンズ多焦点平面顕微鏡（dMUM）と呼ばれます。^[18]

• UT サウスウェスタン医療センターの Ward Ober Lab の Web ページ。
• FandPLimitToolホームページ
• MUMDesignToolホームページ