蛍光干渉顕微鏡

蛍光干渉コントラスト (FLIC) 顕微鏡は、ナノメートル スケールの Z 解像度を実現するために開発された 顕微鏡技術です。

FLIC は、蛍光物体が反射面 (例: Si ウェーハ) の近くにある場合に発生します。直接光と反射光が干渉し、反射面からの距離 h の関数として蛍光物体の強度 I が 2 倍の sin ²変調されます。これにより、ナノメートル単位の高さ測定が可能になります。

FLIC 顕微鏡は、人工脂質二重層、生体細胞膜、または表面上の 蛍光標識タンパク質の構造など、蛍光プローブを含む膜のトポグラフィーを測定するのに適しています。

FLIC の基礎となる光学理論は、Armin Lambacher 氏と Peter Fromherz 氏によって開発されました。彼らは、観測された蛍光強度と、反射シリコン表面からの蛍光体の距離との関係を導き出しました。

観測される蛍光強度 は、単位時間あたりの励起確率と、単位時間あたりに放出された光子が測定される確率 の積です。両方の確率は、シリコン表面からの蛍光体の高さの関数であるため、観測される強度も蛍光体の高さの関数になります。 最も単純な配置は、シリコン (屈折率)との界面から距離d のところに蛍光体が埋め込まれている場合です。 蛍光体は、波長 の光によって励起され、波長 の光を放出します。 単位ベクトル は、蛍光体の励起の 遷移双極子の方向を示します。 は、局所電場の二乗投影に比例します。これには、遷移双極子の方向に対する 干渉の影響が含まれます。 蛍光体における 局所電場 は、直接入射光とシリコン表面で反射した光との干渉の影響を受けます。 干渉は、 によって与えられる 位相差によって定量化されます。は、シリコン面の法線に対する入射光の角度です。干渉は を変調するだけでなく、シリコン表面は入射光を完全には反射しません。フレネル係数は、入射波と反射波の振幅の変化を与えます。フレネル係数は、入射角、および、2 つの媒体の屈折率、および偏光方向に依存します。角度と は、スネルの法則によって関連付けられます。反射係数の式は次のとおりです。TE は、入射面に垂直な電場の成分、TM は平行な成分を指します (入射面は、面法線と光の伝播方向によって定義されます)。直交座標では、局所電場は、 入射面に対する入射光の偏光角です。励起双極子の方向は、入射面の法線に対する角度と入射面の方位角の関数です。 上記の および の 2 つの式を組み合わせると、単位時間あたりに蛍光体が励起される確率が得られます。 上記で使用したパラメーターの多くは、通常の実験では変化します。この理論的説明には、次の 5 つのパラメータの変化を含める必要があります。 ${\displaystyle I_{FLIC}}$${\displaystyle P_{ex}}$${\displaystyle P_{em}}$${\displaystyle n_{1}}$${\displaystyle n_{0}}$${\displaystyle \lambda_{ex}}$${\displaystyle \lambda_{em}}$${\displaystyle ''e_{ex}''}$${\displaystyle P_{ex}}$${\displaystyle F_{in}}$
${\displaystyle P_{ex}\propto \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}$
${\displaystyle F_{in}}$${\displaystyle \Phi _{in}}$
${\displaystyle \Phi _{in}={\frac {4\pi n_{1}d\cos \theta _{1}^{in}}{\lambda _{ex}}}}$
${\displaystyle \theta _{1}^{in}}$${\displaystyle F_{in}}$${\displaystyle \theta_{i}}$${\displaystyle \theta_{j}}$${\displaystyle \theta_{i}}$${\displaystyle \theta_{j}}$
${\displaystyle r_{ij}^{TE}={\frac {n_{i}\cos \theta _{i}-n_{j}\cos \theta _{j}}{n_{i}\cos \theta _{i}+n_{j}\cos \theta _{j}}\quad r_{ij}^{TM}={\frac {n_{j}\cos \theta _{i}-n_{i}\cos \theta _{j}}{n_{j}\cos \theta _{i}+n_{i}\cos \theta _{j}}}}$

${\displaystyle F_{in}=\sin \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}0\\1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\\0\end{array}}\right]+\cos \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}\cos \theta _{1}^{in}(1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\\0\\\sin \theta _{1}^{in}(1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\end{array}}\right]}$
${\displaystyle \gamma _{in}}$${\displaystyle \theta _{ex}}$${\displaystyle \phi _{ex}}$
${\displaystyle {\textit {e}}_{ex}=\left[{\begin{array}{c}\cos \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\sin \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\cos \theta _{ex}\end{array}}\right]}$
${\displaystyle F_{in}}$${\displaystyle {\textit {e}}_{ex}}$${\displaystyle P_{ex}}$

• 励起光のコヒーレンス
• 励起光の入射角（ ）${\displaystyle \theta _{1}^{in}}$
• 励起光の偏光角（ ）${\displaystyle \gamma _{in}}$
• 蛍光体の遷移双極子の角度（ ）${\displaystyle \theta _{ex}}$
• 励起光の波長（）${\displaystyle \lambda_{ex}}$

励起の確率を求めるには、これらの量について二乗投影を平均化する必要がある。最初の4つのパラメータを平均化すると、 ${\displaystyle \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}$${\displaystyle P_{ex}}$
${\displaystyle <\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>\propto \int \sin \theta _{1}^{in}d\theta _{1}^{in}A_{in}(\theta _{1}^{in})\times \int \sin \theta _{ex}d\theta _{ex}O(\theta _{ex})U_{ex}(\lambda _{in},\theta _{1}^{in}.\theta _{ex})}$ ${\displaystyle U_{ex}=\sin ^{2}\theta _{ex}\mid 1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+\sin ^{2}\theta _{ex}\cos ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+2\cos ^{2}\theta _{ex}\sin ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}}$

正規化係数は含まれません。 は蛍光体双極子の配向角の分布です。方位角と偏光角は解析的に積分されるため、上記の式には表示されなくなります。最終的に単位時間あたりの励起確率を得るには、蛍光体の強度と消衰係数を考慮して、上記の式を励起波長の広がりにわたって積分します。 計算手順は、パラメータ ラベルemがexに、in がoutに置き換えられていることを除いて、上記の計算手順と同じです。 測定された結果の蛍光強度は、励起確率と発光確率の積に比例します 。${\displaystyle O(\theta _{ex})}$${\displaystyle \phi _{ex}}$${\displaystyle \gamma _{in}}$${\displaystyle I(\lambda _{ex})}$${\displaystyle \epsilon (\lambda _{ex})}$
${\displaystyle P_{ex}\propto \int d\lambda _{ex}I(\lambda _{ex})\epsilon (\lambda _{ex})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}$
${\displaystyle P_{em}}$${\displaystyle P_{ex}}$
${\displaystyle P_{em}\propto \int d\lambda _{em}\Phi _{det}(\lambda _{em}){\textit {f}}(\lambda _{em})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}$

${\displaystyle I_{FLIC}\propto P_{ex}P_{em}}$
この理論では、測定された蛍光強度と反射面上の蛍光体の距離との間に比例関係が定められていることに注意することが重要です。これが等式関係ではないという事実は、実験手順に大きな影響を与えます。 ${\displaystyle I_{FLIC}}$

FLIC 実験では、反射面としてシリコン ウェーハが一般的に使用されます。次に、スペーサーとして機能するようにシリコン ウェーハ上に熱酸化層を成長させます。酸化物の上に、脂質膜、細胞、膜結合タンパク質などの蛍光標識標本を配置します。サンプル システムを構築したら、定量的な強度測定を行うために必要なのは、落射蛍光顕微鏡とCCDカメラだけです。

二酸化ケイ素の厚さは、正確な FLIC 測定を行う上で非常に重要です。前述のように、理論モデルは、蛍光体の高さに対して測定された相対的な蛍光強度を表します。蛍光体の位置は、測定された単一の FLIC 曲線から単純に読み取ることはできません。基本的な手順は、少なくとも 2 つの既知の厚さを持つ酸化物層を製造することです (層はフォトリソグラフィー技術で作成し、厚さはエリプソメトリーで測定できます)。使用される厚さは、測定されるサンプルによって異なります。蛍光体の高さが 10 nm の範囲にあるサンプルの場合、酸化物の厚さは約 50 nm が最適です。これは、FLIC 強度曲線がこの範囲で最も急勾配になり、蛍光体の高さ間のコントラストが最大になるためです。酸化物の厚さが数百ナノメートルを超えると、曲線が多色光とさまざまな入射角によってぼやけ始めるため、問題が発生する可能性があります。異なる酸化物の厚さで測定された蛍光強度の比率を予測比率と比較し、酸化物上の蛍光体の高さ ( ) を計算します。 次に、上記の式を数値的に解いて を求めます。実験の不完全性、たとえば不完全な反射、光の非垂直入射、多色光などは、シャープな蛍光曲線をぼかす傾向があります。入射角の広がりは、開口数(NA) によって制御できます。ただし、使用する開口数に応じて、実験では良好な横方向解像度(xy) または良好な垂直解像度 (z) が得られますが、両方が得られるわけではありません。高い NA (~1.0) では良好な横方向解像度が得られ、長距離トポグラフィーの決定が目的の場合に最適です。一方、低い NA (~0.001) では、システム内の蛍光標識分子の高さを決定するために正確な z 高さ測定が提供されます。 ${\displaystyle d_{\textit {f}},}$
${\displaystyle {\frac {I_{theory}(d_{1})}{I_{theory}(d_{0})}}={\frac {I_{exp}(d_{1}+d_{\textit {f}})}{I_{exp}(d_{0}+d_{\textit {f}})}}}$
${\displaystyle d_{\textit {f}}}$

基本的な分析では、強度データを理論モデルにフィッティングし、酸化物表面からの蛍光体の距離 ( ) を自由パラメータとします。酸化物からの蛍光体の距離が増加すると、FLIC 曲線は左にシフトします。 は 通常、関心のあるパラメータですが、フィッティングを最適化するために、他のいくつかの自由パラメータが含まれることがよくあります。通常、振幅係数 (a) と背景の定数加算項 (b) が含まれます。振幅係数は相対モデル強度をスケーリングし、一定の背景は、細胞の上面など焦点外の領域から来る蛍光を考慮して曲線を上下にシフトします。顕微鏡の開口数 (NA) をフィッティングの自由パラメータとすることができる場合もあります。光学理論に含まれる他のパラメータ、たとえば異なる屈折率、層の厚さ、光の波長などは、ある程度の不確実性はあるものの一定であると想定されます。FLIC チップは、ブロック状に配置された 9 または 16 の異なる高さの酸化物テラスで作成できます。蛍光画像が撮影されると、9 または 16 のテラス ブロックごとに、一意の を定義する個別の FLIC 曲線が生成されます。平均値は、すべての値をヒストグラムに コンパイルして求められます。の計算における 統計誤差は、光学理論をデータに適合させる際の誤差と、酸化層の厚さの不確実性の 2 つの原因から生じます。 系統的誤差は、酸化層の厚さの測定 (通常はエリプソメーターによる)、CCD による蛍光強度の測定、および光学理論で使用されるパラメータの不確実性の 3 つの原因から生じます。系統的誤差は と推定されています。 ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$${\displaystyle d_{\textit {f}}}$${\displaystyle d_{\textit {f}}}$${\displaystyle d_{\textit {f}}}$${\displaystyle d_{\textit {f}}}$
${\displaystyle d_{\textit {f}}}$${\displaystyle \sim 1nm}$

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