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位相差顕微鏡（PCM）は、透明な試料を通過する光の位相差を画像の明るさの変化に変換する光学顕微鏡技術です。位相差自体は目に見えませんが、明るさの変化として表示されることで可視化されます。
光波が真空以外の媒質を通過する際、媒質との相互作用によって波の振幅と位相が変化し、その変化の仕方は媒質の特性に依存します。振幅（明るさ）の変化は光の散乱と吸収によって生じ、これは波長に依存することが多く、色を生じさせる場合もあります。写真機器や人間の目は振幅の変化にしか反応しません。そのため、特別な装置を用いない限り、位相の変化は目に見えません。しかし、位相の変化はしばしば重要な情報を伝えます。
位相差顕微鏡は生物学において特に重要です。図に示されているように、明視野顕微鏡では見えない多くの細胞構造を明らかにします。これらの構造は、以前の顕微鏡学者によって染色によって可視化されていましたが、そのためには追加の準備と細胞の死が必要でした。位相差顕微鏡により、生物学者は生きた細胞と、細胞分裂によってどのように増殖するかを研究することが可能になりました。これは、蛍光を使用せずに細胞構造と構成要素を定量化できる数少ない方法の 1 つです。[ 1 ] 1930 年代初頭に発明されて以来、[ 2 ]位相差顕微鏡は顕微鏡学の進歩であることが証明され、発明者のフリッツ・ゼルニケは1953 年にノーベル物理学賞を受賞しました。[ 3 ]この顕微鏡を製造した女性、キャロライン・ブリーカーは、しばしば功績が認められていません。
位相差顕微鏡で位相変化を可視化するための基本原理は、照明光（背景光）と試料散乱光（前景の細部を構成する光）を分離し、それぞれを異なる方法で操作することである。
コンデンサー環状部を通過する環状照明光（図中の緑色で示されている）は、コンデンサーによって試料上に集光されます。照明光の一部は試料（黄色）によって散乱されます。残りの光は試料の影響を受けず、背景光（赤色）を形成します。染色されていない生物試料を観察する場合、散乱光は弱く、背景光に対して通常-90°位相がずれています（これは、試料の一般的な厚さと、生物組織と周囲の媒質との屈折率の差の両方によるものです）。このため、前景（図中の青色のベクトル）と背景（赤色のベクトル）の強度がほぼ同じになり、画像のコントラストが低くなります。
位相差顕微鏡では、像のコントラストは2つの方法で向上します。1つは、視野内の標本を含む領域で散乱光線と背景光線の間に建設的干渉を生成すること、もう1つは、像面に到達する背景光の量を減らすことです。[ 4 ]まず、背景光を位相シフトリングに通すことで-90°位相シフトさせ、背景光線と散乱光線の間の位相差をなくします。
光が像面（カメラや接眼レンズが配置されている面）に集光されると、この位相シフトによって、試料を含む視野領域（すなわち前景）から発せられる背景光と散乱光が強め合い、試料を含まない領域に比べてこれらの領域の明るさが増します。最後に、背景光はニュートラルデンシティフィルターリングによって約70～90%減光されます。この方法により、照明光によって生成される散乱光の量が最大化され、像面に到達する照明光の量が最小化されます。フィルター表面全体を照らす散乱光の一部は、リングによって位相シフトされ減光されますが、位相シフトリングとニュートラルデンシティフィルターリングのみを照らす背景光に比べると、その程度ははるかに小さくなります。
上記は負の位相コントラストについて説明した。正の位相コントラストでは、背景光は+90°位相がずれる。したがって、背景光は散乱光に対して180°位相がずれる。散乱光は背景光から差し引かれ、最初の図に示すように、前景が暗く背景が明るい画像が形成される。[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]
位相差顕微鏡の成功により、その後の位相イメージング法が数多く開発されました。1952年、ジョルジュ・ノマルスキーは、今日では微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡として知られる技術の特許を取得しました。[ 8 ] これは、対象物が横から照らされているかのように人工的な影を作り出すことでコントラストを高めます。しかし、DIC顕微鏡は、対象物またはその容器が偏光状態を変化させる場合には適していません。細胞生物学において偏光プラスチック容器の使用が増加するにつれて、DIC顕微鏡は、1975年にロバート・ホフマンによって発明されたホフマン変調コントラスト顕微鏡に取って代わられつつあります。 [ 9 ]
従来の位相差法は、明るさと位相情報を単一の画像に融合させることで、光学的にコントラストを高めます。1990年代半ばにデジタルカメラが導入されて以来、定量位相差顕微鏡法として知られるいくつかの新しいデジタル位相イメージング法が開発されました。これらの方法は、通常の明視野画像と、いわゆる位相シフト画像という2つの別々の画像をデジタル的に作成します。各画像点において、位相シフト画像には、物体によって誘発される定量化された位相シフトが表示され、これは物体の光学的厚さに比例します。 [ 10 ]このように、関連する光場を測定することで、光学的逆問題を解いて物体の散乱ポテンシャルを計算によって再構築することにより、従来の位相差法に伴うハローアーティファクトを補正することができます。[ 11 ]