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ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の歴史は、古典的な「ユリイカ！」の瞬間[ 1 ]、あるいは異分野の研究者間の協力的なチームワークの例として様々に表現されてきた[ 2 ] 。 以下は、その開発前、開発中、開発後の出来事のリストである。
- 鋳型鎖の全長がプライマーと適切に複合体を形成した2つの構造が得られることが期待される。DNAポリメラーゼを添加することで、修復複製プロセスが完了する。元の二本鎖DNA分子が2つ生成されるはずである。このサイクル全体を繰り返すことができ、その都度、新しい酵素を添加する。
1980年までに、PCR増幅に必要なすべての構成要素は科学界に知られるようになった。オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのDNAポリメラーゼの使用は、DNAシーケンスやクローニングおよび発現のためのcDNAの作製において一般的な手順であった。ニックトランスレーションのためのDNAポリメラーゼの使用は、サザンブロッティング用のDNAプローブを標識するために最も一般的に使用された方法であった。
通常の業界慣行に従い、マリスはPCRの基本概念と多くの潜在的な応用を網羅する特許を申請し[17]、特許庁からより多くの結果を含めるよう求められた。1985年3月28日、マリスの開発グループはPCRとオリゴマー制限による鎌状赤血球貧血変異の解析に焦点を当てた特許を申請した[ 18 ]。修正後、両方の特許は1987年7月28日に承認された。
1985年の春、開発グループはPCR技術を他の標的にも適用し始めた。プライマーとプローブは、ヒト白血球抗原DQα遺伝子の可変セグメント用に設計された。この反応はβ-ヘモグロビン標的の場合よりもはるかに特異性が高く、期待されるPCR産物[ 15 ]はアガロースゲル電気泳動で直接確認できた。さまざまなソースからの増幅産物もクローニングされ、配列決定され、PCRによる新しいアレルの最初の決定となった[ 15 ]。 同時に、元のオリゴマー制限アッセイ技術は、より一般的なアレル特異的オリゴヌクレオチド法に置き換えられた[ 19 ] 。
また、1985 年初頭、研究グループは耐熱性 DNA ポリメラーゼの使用を開始しました (元の反応で使用された酵素は、加熱の各ステップで破壊されます)。当時[ 1 ] 、 TaqとBstの 2 つしか報告されていませんでした。Taq ポリメラーゼに関する報告[ 12 ]の方が詳細だったので、テスト用に選ばれました。Bst ポリメラーゼは後に PCR には不向きであることが判明しました。その夏、Mullis は酵素の単離を試み、Cetus 以外のグループに製造を委託しましたが、いずれも成功しませんでした。1985 年秋、Cetus の Susanne Stoffel と David Gelfand がポリメラーゼの製造に成功し、Randy Saiki によってすぐに PCR プロセスをサポートすることが発見されました。
特許が提出されると、PCRを一般の科学コミュニティに報告する作業が進められた。 1985年4月にソルトレイクシティで開催された米国人類遺伝学会の会議に抄録が提出され、10月に斎木によってPCRの最初の発表が行われた。[ 20 ] 2つの論文が計画された。1つはマリスによる「アイデア」論文、もう1つは開発グループ全体による「応用」論文である。マリスは論文をNature誌に投稿したが、結果が含まれていないとして却下された。もう1つの論文は主にOR分析アッセイについて記述しており、1985年9月20日にScienceに投稿され、11月に受理された。12月にマリスの報告が却下された後、PCRプロセスの詳細が2番目の論文に急遽追加され、1985年12月20日に掲載された。[ 16 ]
1986 年 5 月、マリスはコールド スプリング ハーバー シンポジウムで PCR を発表し[ 21 ]、その後ずっと後に、彼のオリジナルの「アイデア」原稿の修正版を出版しました[ 22 ]。PCR を使用した最初の Cetus 以外のレポートは 1986 年 9 月 5 日に提出され[ 23 ] 、他の研究室がいかに早くこの技術を導入し始めたかを示しています。Cetus 開発グループは 1986 年 9 月 8 日に PCR 産物の詳細な配列解析を発表し[ 15 ] 、1986 年 11 月 13 日にASOプローブの使用を発表しました[ 19 ]。
Taqポリメラーゼを用いたPCR法は、 1986年9月20日にベルリンで開催された会議でヘンリー・エルリッヒによって発表され、1987年10月に論文として提出され、翌年初めに発表された。[ 24 ] Taqポリメラーゼを用いたPCR法の特許は1987年6月17日に出願され、1990年10月23日に発行された。[ 25 ]
1985年12月、Cetus社とPerkin-Elmer社はPCR用の機器と試薬を開発するために合弁会社を設立した。Klenow法に基づく増幅を行うための複雑なサーマルサイクラーが開発されたが、市販されることはなかった。Taqポリメラーゼを用いたPCR用のよりシンプルな装置が開発され、1987年11月19日、プレスリリースで「PCR-1000サーマルサイクラー」と「AmpliTaq DNAポリメラーゼ」の市販開始が発表された。
1985年の春、Cetusのジョン・スニンスキーは、血液中に循環するHIVの量を測定するという困難な作業にPCRを使用し始めた。実用的な検査法は1986年4月11日に発表され、1987年5月に出版された。[ 26 ] これにより、献血された血液をウイルスについてスクリーニングし、抗ウイルス薬の効果を直接監視することが可能になった。
1985年、開発チームのメンバーでもあったノーム・アーンハイムは、セタスでのサバティカルを終え、南カリフォルニア大学の教員職に就任した。彼は、標的配列の単一コピーのみを含むサンプルを増幅するためのPCRの使用について研究を開始した。1989年までに、彼の研究室は、減数分裂組換えの産物を直接分析するために、単一精子に対するマルチプレックスPCRを開発した。[ 27 ] Taqポリメラーゼの特性評価中に最初に実行されたこれらの単一コピー増幅[ 24 ]は、古代DNAの研究や、着床前胚の遺伝子型判定に不可欠となった。
1986年、Cetusビルで働く法医学者のエドワード・ブレイクは、Cetusの研究者であるヘンリー・アーリックと協力し、PCRを犯罪証拠の分析に応用した。古い事件のDNAサンプルのパネルが収集され、コード化され、HLA DQαアッセイを使用してサイキによって盲検的に分析された。コードが解読されると、すべての証拠と犯人が一致した。ブレイクとアーリックのグループは、この技術をほぼすぐにペンシルバニア対ペスティニカス事件[28]で使用した。これは、刑事事件でPCRが初めて使用された事例である。このDQαテストは、Cetusが「Ampli-Type」キットの1つとして開発し、 OJシンプソン殺人事件などの法医学的証拠の検査の初期プロトコルの一部となった。
1989年までに、以前に最初のDNAフィンガープリンティング検査を開発し応用したアレック・ジェフリーズは、PCRを使用して感度を高めた。[ 29 ]さらに改良を加え、高度に多型性を示す可変数タンデムリピート（VNTR）遺伝子座 の増幅は、統合DNAインデックスシステム（CODIS）などの国家DNAデータベースの標準プロトコルとなった。
1987年、ラス・ヒグチは人間の毛髪からDNAを増幅することに成功した。[ 30 ]この研究は、古代DNAや法医学的証拠 など、高度に劣化しているサンプルからDNAを増幅する方法の開発へと発展した。