k-メール

バイオインフォマティクスにおいて、k -merは生物学的配列内に含まれる長さの部分文字列である。主に計算ゲノム学と配列解析の文脈で使用され、k - merはヌクレオチド（すなわち、A 、 T 、 G、およびC）で構成され、 DNA配列の組み立て、^[1]、異種遺伝子発現の改善、^{[2] [3]、}メタゲノムサンプル内の種の特定、^[4]、および弱毒化ワクチンの作成に利用されている。^[5]通常、 k -merという用語は、配列の長さのすべての部分配列を指す。たとえば、配列AGATには、4つのモノマー（A、G、A、およびT）、3つの2-mer（AG、GA、AT）、2つの3-mer（AGAおよびGAT）、および1つの4-mer（AGAT）がある。より一般的には、長さのシーケンスにはkマーと、可能な合計kマーが含まれます。ここで、 は可能なモノマーの数です (たとえば、 DNAの場合は 4 )。 ${\displaystyle k}$ ${\displaystyle k}$${\displaystyle L}$${\displaystyle L-k+1}$ ${\displaystyle n^{k}}$${\displaystyle n}$

kマーは単に長さの部分配列です。たとえば、DNA 配列の 可能なすべてのkマーを以下に示します。${\displaystyle k}$

k -merを視覚化する手法であるk -merスペクトルは、配列内の各k -merの多重度と、その多重度を持つk -merの数との関係を示します。^[6]種のゲノムのk -merスペクトルのモード数はさまざまで、ほとんどの種は単峰性分布を示します。 ^[7]ただし、すべての哺乳類は多峰性分布を示します。k - merスペクトル内のモード数は、ゲノムの領域によっても異なる場合があります。ヒトは、5' UTRとエクソンでは単峰性のk -merスペクトルを示しますが、 3' UTRとイントロンでは多峰性のスペクトルを示します。

k merの使用頻度は、複数のレベルで作用する多数の力の影響を受けますが、これらの力はしばしば矛盾します。kの値が大きい場合のk mer は、 kの値が小さい場合に影響を与える力の影響も受けることに注意することが重要です。たとえば、1 mer A がシーケンスに出現しない場合、A を含む 2 mer (AA、AT、AG、および AC) も出現しないため、さまざまな力の影響が結びつきます。

k = 1の場合、DNA k量体は 4 つ、つまりA、T、G、Cです。分子レベルでは、G と C の間には 3 つの水素結合がありますが、A と T の間には 2 つしかありません。GC 結合は、追加の水素結合 (およびより強いスタッキング相互作用) の結果として、AT 結合よりも熱的に安定しています。^[8]哺乳類と鳥類は、G と C の比率が As と T の比率 ( GC 含有量) よりも高いため、熱安定性が GC 含有量変動の駆動要因であるという仮説が生ま​​れました。^[9]しかし、この仮説は有望ではあるものの、精査では成り立ちませんでした。さまざまな原核生物の分析では、熱適応仮説が予測するように GC 含有量が温度と相関しているという証拠は示されませんでした。^[10]実際、自然選択が GC 含有量変動の駆動力である場合、生物の適応度を変えるには、多くの場合サイレントである単一のヌクレオチドの変化が必要になります。 ^[11]

むしろ、現在の証拠は、GC偏向遺伝子変換（gBGC）がGC含有量の変動の原動力であることを示唆している。^{[11] gBGCは、}組換え中に発生するプロセスであり、AとTをGとCに置き換えます。^[12]このプロセスは自然選択とは異なりますが、ゲノム内でGC置換が固定されるように偏向したDNAに選択圧を及ぼす可能性があります。したがって、gBGCは自然選択の「詐欺師」と見なすことができます。予想どおり、組換えが多い場所ではGC含有量が多くなります。^[13]さらに、組換え率が高い生物はGC含有量が高く、gBGC仮説の予測された効果と一致しています。^{[14]興味深いことに、gBGCは}真核生物に限定されないようです。^[15]細菌や古細菌などの無性生物も、遺伝子変換による組換えを経験します。遺伝子変換は、相同配列の置換プロセスであり、ゲノム全体で複数の同一配列をもたらします。^[16]組み換えによって生命のあらゆる領域でGC含有量が上昇するということは、gBGCが普遍的に保存されていることを示唆している。gBGCが（ほとんど）中立的な生命の分子機構の副産物なのか、それともそれ自体が選択を受けているのかはまだ明らかにされていない。gBGCの正確なメカニズムと進化上の利点や欠点は現在不明である。^[17]

GC 含量バイアスについて論じた文献は比較的多いが、ジヌクレオチド バイアスについて書かれた文献は比較的少ない。分かっていることは、これらのジヌクレオチド バイアスはゲノム全体で比較的一定であるが、GC 含量は前述のように大幅に変化する可能性があるということである。^{[18]これは見逃してはならない重要な洞察である。ジヌクレオチド バイアスが}翻訳に起因する圧力の影響を受ける場合、一部のジヌクレオチドの翻訳効率の低下によって、コード領域と非コード領域でジヌクレオチド バイアスのパターンが異なるはずである。 ^[19]そのようなことは起こらないため、ジヌクレオチド バイアスを調節する力は翻訳とは無関係であると推測できる。翻訳圧力がジヌクレオチド バイアスに影響を与えることを否定するさらなる証拠は、翻訳効率に大きく依存するウイルスのジヌクレオチド バイアスは、ウイルスがハイジャックする宿主よりも、ウイルス ファミリーによって形成されるという事実である。^[20]

gBGCのGC含量の増加とは対照的にCG抑制が起こり、メチル化されたCGジヌクレオチドの脱アミノ化によりCG 2量体の頻度が減少し、CGがTGに置換され、GC含量が減少します。^[21]この相互作用は、kの値を変化させた場合のk量体に影響を及ぼす力の相互関係を浮き彫りにしています。

ジヌクレオチドバイアスに関する興味深い事実の1つは、系統学的に類似したゲノム間の「距離」の測定として機能できることです。近縁関係にある生物のペアのゲノムは、遠縁の生物のペアのゲノムよりも類似したジヌクレオチドバイアスを共有しています。^[18]

DNAがコードするタンパク質を作るのに使われる天然アミノ酸は20種類ある。しかし、ヌクレオチドは4種類しかない。そのため、ヌクレオチドとアミノ酸を1対1で対応付けることはできない。同様に、2量体は16種類あるが、これもすべてのアミノ酸を一義的に表すには不十分である。しかし、DNAには64の異なる3量体があり、各アミノ酸を一意に表すには十分である。これらの重複しない3量体はコドンと呼ばれる。各コドンは1つのアミノ酸にしか対応しないが、各アミノ酸は複数のコドンで表すことができる。したがって、同じアミノ酸配列が複数のDNA表現を持つことができる。興味深いことに、アミノ酸の各コドンは均等な割合で使用されていない。^{[22]これは}コドン使用バイアス（ CUB）と呼ばれる。k = 3の場合、真の3量体頻度とCUBを区別する必要がある。たとえば、配列 ATGGCA には 3 mer の単語が 4 つ (ATG、TGG、GGC、GCA) ありますが、コドンは 2 つ (ATG と GCA) しかありません。ただし、CUB は 3 mer の使用バイアスの主な推進要因であり (コード領域内のk mer の 1/3 はコドンであるため、最大 1/3 を占めます)、このセクションでは主に CUB に焦点を当てます。

さまざまなコドンの頻度の変動の正確な原因は完全には解明されていません。コドンの好みはtRNAの存在量と相関しており、より豊富なtRNAと一致するコドンはそれに応じてより頻繁に発生し^[22]、より高度に発現するタンパク質はより大きなCUBを示すことが知られています。^[23]これは、翻訳効率または精度の選択がCUBの変動の原動力であることを示唆しています。

二ヌクレオチドバイアスに見られる効果と同様に、系統学的に類似した生物のテトラヌクレオチドバイアスは、それほど近縁ではない生物間よりも類似しています。^[4]テトラヌクレオチドバイアスの変動の正確な原因は十分に理解されていませんが、分子レベルでの遺伝的安定性の維持の結果であるという仮説が立てられています。^[24]

種のゲノム、ゲノム領域、または配列のクラスにおけるk量体セットの頻度は、基礎となる配列の「シグネチャ」として使用できます。これらの頻度の比較は、配列アライメントよりも計算が容易であり、アライメントフリーの配列分析における重要な方法です。また、アライメント前の第 1 段階の分析として使用することもできます。

シーケンスアセンブリでは、De Bruijn グラフの構築中にkマーが使用されます。^{[25] [26]} De Bruijn グラフを作成するには、長さの各辺に格納されているkマーが、別の辺の別の文字列と でオーバーラップして頂点を作成する必要があります。次世代シーケンシングから生成されるリードは、通常、生成されるリード長が異なります。たとえば、イルミナのシーケンシング技術によるリードは、100 マーのリードをキャプチャします。ただし、シーケンシングの問題は、ゲノムに存在する可能性のあるすべての 100 マーのうち、実際に生成されるのはごく一部だけであるということです。これは読み取りエラーによるものですが、より重要なのは、シーケンシング中に発生する単純なカバレッジ ホールです。問題は、可能性のあるk mer のこれらの小さな部分が、すべてのk mer リードがゲノム内の隣接するk merと重複する必要があるという De Bruijn グラフの重要な仮定に違反していることです(これは、可能性のあるすべてのk mer が存在しない場合は発生しません)。 ${\displaystyle L}$${\displaystyle L-1}$${\displaystyle k-1}$

この問題の解決策は、これらのk -merサイズのリードをより小さなk -merに分割することです。その結果得られるより小さなk -merは、ゲノム内に存在するそのより小さなサイズの可能なすべてのk -merを表すことになります。 ^[27]さらに、k -merをより小さなサイズに分割すると、異なる初期リード長の問題も軽減されます。この例では、5つのリードはゲノムの可能な7-merすべてを考慮していないため、De Bruijnグラフを作成することはできません。しかし、それらを4-merに分割すると、結果のサブシーケンスはDe Bruijnグラフを使用してゲノムを再構築するのに十分です。

k -merは、配列アセンブリに直接使用されるだけでなく、過剰に表現されているk -merを特定することでゲノムの誤ったアセンブリを検出するためにも使用できます。これは、結合された繰り返しDNA配列の存在を示唆しています。 ^[28]さらに、k -merは、真核生物のゲノムアセンブリ中に細菌汚染を検出するためにも使用され、これはメタゲノミクスの分野から借用されたアプローチです。^{[29] [30]}

k -mer サイズの選択は、配列アセンブリにさまざまな影響を与えます。これらの影響は、小さいサイズの k-mer と大きいサイズのk -mer の間で大きく異なります。したがって、影響のバランスが取れた適切なサイズを選択するには、さまざまなk -mer サイズを理解する必要があります。サイズの影響について以下に概説します。

• k -mer サイズを小さくすると、グラフに格納されるエッジの量が減り、DNA 配列を格納するために必要なスペースの量も減ります。
• サイズが小さいほど、すべてのk -merが重なり合う可能性が高くなり、De Bruijnグラフを構築するために必要な部分列を持つことになります。^[31]
• ただし、 k -mer のサイズが小さくなると、グラフ内の頂点が 1 つの k-mer につながるリスクも生じます。そのため、通過する必要のある頂点の数が多くなり、パスのあいまいさのレベルが高くなるため、ゲノムの再構築がより困難になります。
• kマーが小さくなるにつれて情報が失われます。
  • たとえば、 AGTCGTAGATGCTG の可能性は ACGT よりも低いため、より多くの情報を保持します (詳細については、エントロピー (情報理論)を参照してください)。
• より小さなk -mer には、小さなマイクロサテライトや繰り返しが発生するDNA 領域を解決できないという問題もあります。これは、より小さなk -mer は繰り返し領域内に完全に収まる傾向があるため、実際に発生した繰り返しの量を判断するのが難しいためです。
  • たとえば、サブシーケンス ATGTGTGTGTGTGTACG の場合、 k -mer サイズを 16 未満にすると、TG の繰り返し回数が失われます。これは、 k -mer のほとんどが繰り返し領域にあり、繰り返し回数を参照する代わりに、同じk -mer の繰り返しとして破棄される可能性があるためです。

• k -mer のサイズが大きくなるとグラフ内のエッジの数が増え、DNA 配列を保存するために必要なメモリの量も増えます。
• k -merのサイズを大きくすると、頂点の数も減ります。これにより、グラフ内を移動するパスが少なくなり、ゲノムの構築が容易になります。^[31]
• k -merが大きくなると、すべての k-mer からの外向きの頂点がないリスクも高くなります。これは、k -mer が大きくなると、別のk -merと重複しないリスクが大きくなるためです。したがって、読み取りに不整合が生じ、結果として、より小さなコンティグの数が多くなる可能性があります。${\displaystyle k-1}$
• k -mer のサイズが大きいほど、小さな繰り返し領域の問題を軽減できます。これは、k -mer に繰り返し領域と隣接する DNA 配列 (十分な大きさの場合) のバランスが含まれるため、特定の領域での繰り返しの量を解決するのに役立つためです。

疾患に関しては、二ヌクレオチドバイアスは病原性に関連する遺伝子島の検出に応用されている。^{[11]これまでの研究では、四ヌクレオチドバイアスが原核生物[32]と真核生物[33]}の両方で水平遺伝子伝達を効果的に検出できることも示されている。

k -merのもう一つの応用は、ゲノムベースの分類学です。例えば、GC 含量はErwinia属の種を区別するために使用され、ある程度の成功を収めています。^[34]分類学の目的で GC 含量を直接使用するのと同様に、DNA の融解温度であるT mが使用されます。GC 結合は熱的に安定しているため、GC 含量が高い配列はより高い T m を示します。1987 年、細菌系統学へのアプローチの調和に関する特別委員会は、系統発生的種概念の一部として種の境界を決定する要素としてΔT mを使用することを提案しましたが、この提案は科学界で支持を得ていないようです。^[35]

遺伝学とゲノミクスにおけるその他の応用としては、以下のものがあります。

• RNA-seqデータからのRNAアイソフォーム定量^[36]
• ヒトミトコンドリアハプログループの分類^[37]
• ゲノム中の組み換え部位の検出^[38]
• k -mer頻度とk -mer深度を用いたゲノムサイズの推定^{[39] [40]}
• CpGアイランドの隣接領域による特徴づけ^{[41] [42]}
• 転移因子などの反復配列のde novo検出^[43]
• 種のDNAバーコーディング 。^{[7] [44]}
• タンパク質結合配列モチーフの特徴づけ^[45]
• 次世代シークエンシングデータを用いた変異または多型の同定^[46]

k -mer頻度とスペクトル変動は、メタゲノミクスの解析^{[47] [48]}とビニングの両方で頻繁に使用されています。ビニングでは、シーケンスリードを各生物（または操作分類単位）のリードの「ビン」に分離し、それらを組み立てることが課題です。TETRAは、メタゲノムサンプルを取得し、テトラヌクレオチド（k = 4）頻度に基づいて生物にビニングする注目すべきツールです。^[49]  同様にk -mer頻度をメタゲノムビニングに利用する他のツールには、CompostBin（k = 6）、^[50] PCAHIER、^[51] PhyloPythia（5 ≤ k ≤ 6）、^[52] CLARK（k ≥ 20）、^[53]およびTACOA（2 ≤  k  ≤ 6）があります。^{[54]最近の開発では、} k -merを使用したメタゲノムビニングにディープラーニングも適用されています。^[55]

メタゲノミクスのその他のアプリケーションには次のものがあります。

• 生の読み取りからの読み取りフレームの回復^[56]
• メタゲノムサンプル中の種の豊富さの推定^[57]
• サンプル中に存在する種の決定^{[58] [59]}
• サンプルからの疾患バイオマーカーの同定^[60]

DNA 配列のk -mer 頻度を変更することは、翻訳効率を制御するためにバイオテクノロジーの用途で広く使用されてきました。具体的には、タンパク質生成速度のアップレギュレーションとダウンレギュレーションの両方に使用されています。

タンパク質生産の増加に関しては、不利なジヌクレオチド頻度を減らすことでタンパク質合成率を高めることができるとされてきた。^[61]さらに、コドン使用バイアスを修正することで、より高いタンパク質発現率を持つ同義配列を作成することができる。^{[2] [3]}同様に、ジヌクレオチドとコドンの最適化を組み合わせたコドンペアの最適化も、発現を高めるために効果的に使用されている。^[62]

翻訳効率を下げるためのk -merの最も研究されている応用は、ワクチンを作るためにウイルスを弱毒化するためのコドンペア操作である。研究者らは、デング熱を引き起こすデングウイルスを再コード化し、そのコドンペアバイアスが野生型よりも哺乳類のコドン使用の好みと異なるようにすることができた。^[63]同一のアミノ酸配列を含んでいるにもかかわらず、再コード化されたウイルスは、強い免疫反応を引き起こしながら、病原性が大幅に弱まったことが示された。このアプローチは、インフルエンザワクチン^[64]やマレック病ヘルペスウイルス（MDV）のワクチンを作成するためにも効果的に使用されている。^{[65]注目すべきことに、MDVを弱毒化するために採用されたコドンペアバイアス操作は、ウイルスの}発癌性を効果的に低下させなかったため、このアプローチのバイオテクノロジー用途の潜在的な弱点が浮き彫りになった。現在までに、コドンペアが非最適化されたワクチンの使用は承認されていない。

後の2つの論文は、コドンペアの非最適化の背後にある実際のメカニズムを説明するのに役立ちます。コドンペアの偏りは、ジヌクレオチドの偏りの結果です。^{[66] [67]}ウイルスとその宿主を研究することにより、両著者は、ウイルスの弱毒化をもたらす分子メカニズムは、翻訳に適さないジヌクレオチドの増加であると結論付けることができました。

GC 含有量はDNA の融点に影響を与えるため、もう 1 つの重要なバイオテクノロジー ツールである PCRのアニーリング温度を予測するために使用されます。

読み取りの可能なk mer を決定するには、文字列の長さを 1 ずつ循環し、長さの各サブ文字列を取り出すだけです。これを実現するための疑似コードは次のとおりです。 ${\displaystyle k}$

手順k-mers(文字列seq, 整数k)は
    L ← 長さ(シーケンス)
    arr ← L − k + 1 個の空文字列の新しい配列

    // seq 内の k-mer の数を反復し、 
    // n 番目の k-mer を出力配列に格納します
    。n ← 0からL − k + 1 までの範囲で排他的に実行します。
        arr[n] ← 文字 n から文字 n + k まで seq の部分列

    リターン​

kの値に対してk merの数は指数関数的に増加するため、kの大きな値 (通常 >10) に対してk mer を数えることは計算上困難な作業です。上記の疑似コードのような単純な実装はkの値が小さい場合には機能しますが、高スループットのアプリケーションやkが大きい場合には適応させる必要があります。この問題を解決するために、さまざまなツールが開発されています。

• Jellyfishはk -merカウントにマルチスレッドのロックフリーハッシュテーブルを使用し、Python、Ruby、Perlバインディングを備えています^[68]
• KMCは、速度を最適化するためにマルチディスクアーキテクチャを使用するk -merカウントツールです^[69]
• Gerbilはハッシュテーブルアプローチを採用しているが、GPUアクセラレーションのサポートが追加されている^[70]
• K-mer解析ツールキット（KAT）は、Jellyfishの改良版を使用してk -merカウントを解析する^[6]

• オリゴヌクレオチド
• ゲノムシグネチャー

• この記事の内容の一部は、PLOS wiki の K-mer からコピーされたもので、Creative Commons Attribution 2.5 Generic (CC BY 2.5) ライセンスの下で利用可能です。

• bioXriv:k-mer
• arXiv: k-mer