第三世代シーケンシング

第三世代シーケンシング（ロングリードシーケンシングとも呼ばれる）は、より長いシーケンスリードを生成するDNAシーケンシング方法の一種であり、2008年から活発に開発が進められている。^[1]

第3世代シーケンシング技術は、次世代シーケンシングとも呼ばれる第2世代シーケンシングよりも大幅に長いリードを生成する能力を持っています。 ^[1]このような利点は、ゲノム科学と生物学の研究全般に重大な影響を及ぼします。しかし、第3世代シーケンシングデータは以前の技術よりもエラー率がはるかに高く、下流のゲノムアセンブリと結果データの分析を複雑にする可能性があります。^[2]これらの技術は活発に開発されており、高いエラー率が改善されると期待されています。構造変異呼び出しなど、エラー率に対する耐性が高いアプリケーションでは、第3世代シーケンシングは、シーケンシングカバレッジの深度が低い場合でも、既存の方法よりも優れていることがわかっています。^[3]

第2世代のプラットフォームとは異なるアプローチを採用したシーケンシング技術は、2008年から2009年にかけて初めて「第3世代」として紹介されました。^[4]

現在、第 3 世代のシーケンシング技術開発の中心となっているのは、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technology、Quantapore (米国カリフォルニア州)、Stratos (米国ワシントン州) などの企業です。これらの企業は、単一 DNA 分子のシーケンシングに対して根本的に異なるアプローチを採用しています。

PacBio は、ゼロモード導波路の特性に基づいて、単一分子リアルタイムシーケンシング (SMRT)のシーケンシングプラットフォームを開発しました。シグナルは、zL ウェルの底に結合した DNA ポリメラーゼによって取り込まれた各ヌクレオチドからの蛍光発光の形で発生します。

Oxford Nanopore の技術では、DNA 分子をナノスケールの細孔構造に通し、細孔の周囲の電界の変化を測定します。一方、Quantapore は独自のナノ孔アプローチを採用しています。Stratos Genomics は、ポリマー挿入物「Xpandomers」を使用して DNA 塩基の間隔を空け、ナノ孔 ssDNA 読み取りの信号対雑音比の問題を回避します。

また、Helicos 社の単一分子蛍光アプローチも注目に値しますが、同社は2015 年秋に倒産しました。

現世代のシーケンシング技術と比較すると、第3世代シーケンシングには、はるかに長い読み取りを生成できるという明らかな利点があります。これらの長い読み取り長により、ゲノムアセンブリ、転写再構成、メタゲノミクスなど、現代の生物学や医学の重要な分野を取り巻く多くの計算上の課題が軽減されると期待されています。^[1]

霊長類やヒトを含む真核生物のゲノムは複雑で、多数の長い繰り返し領域があることはよく知られています。第 2 世代のシーケンシングによる短い読み取りでは、アセンブリと遺伝子変異の呼び出しのために長い範囲にわたる配列を推測するために近似戦略に頼る必要があります。ペアエンド読み取りは、これらの制限に対処するために第 2 世代のシーケンシングで活用されています。ただし、ペアエンドの正確なフラグメント長は不明な場合が多く、近似値も必要です。長い読み取り長を可能にすることで、第 3 世代のシーケンシング技術には明らかな利点があります。

エピジェネティックマーカーは、 DNA分子の配列にはない、安定的で遺伝性の可能性がある修飾です。例としては、遺伝子発現に影響を与えることがわかっているCpG部位でのDNAメチル化があります。ヒストン修飾も別の例です。現在のシーケンシング技術は、エピジェネティックマーカーの検出にChIPシーケンシングなどの実験室技術に依存しています。これらの技術では、DNA鎖にタグを付け、マーカーを含む断片を破壊してフィルタリングした後、シーケンシングを行います。第3世代のシーケンシングでは、他の4つのヌクレオチド塩基とは異なる信号により、これらのマーカーを直接検出できる可能性があります。^[5]

第三世代シーケンシング技術のその他の重要な利点としては、携帯性とシーケンシング速度が挙げられます。^[6]第二世代シーケンシングと比較して、サンプルの前処理が最小限で済むため、より小型の装置を設計できます。オックスフォードナノポアテクノロジーは最近、MinIONシーケンサーを商品化しました。このシーケンシングマシンは、通常のUSBフラッシュドライブとほぼ同じサイズで、ラップトップに接続するだけで簡単に使用できます。さらに、シーケンシングプロセスはゲノムの領域間で並列化されていないため、データはリアルタイムで収集および分析できます。第三世代シーケンシングのこれらの利点は、迅速なオンサイトのデータ収集と分析が求められる病院環境に適している可能性があります。

2008年時点で、第3世代シーケンシングは、主にヌクレオチド塩基の正確な識別に関する重要な課題に直面しており、エラー率は第2世代シーケンシングと比較して依然としてはるかに高かった。^[2]これは通常、関与する分子機構の不安定性によるものである。たとえば、Pac​​Bioの単一分子およびリアルタイムシーケンシング技術では、シーケンシングプロセスが発生するにつれて、DNAポリメラーゼ分子がますます損傷を受ける。^[2]さらに、プロセスは迅速に行われるため、個々の塩基から発せられる信号は、隣接する塩基からの信号によってぼやける可能性がある。これにより、信号を解読し、結果として配列を推測するための新しい計算上の課題が生じる。たとえば、隠れマルコフモデルなどの方法は、この目的に活用され、ある程度の成功を収めている。^[5]

平均して、人間の異なる個体は遺伝子の約 99.9% を共有しています。言い換えれば、2 人の人間の間で異なる塩基は、約 1,000 個に 1 個程度です。第 3 世代のシーケンシングに伴う高いエラー率は、同じ種のメンバー間に存在する個体差を特徴付けるという目的には、必然的に問題となります。^{[引用が必要]}

ゲノムアセンブリは、ゲノム DNA 配列全体を再構築することです。これは通常、2 つの根本的に異なるアプローチで行われます。

参照ゲノムが利用できる場合 (ヒトの場合など)、新しく配列されたリードは参照ゲノムに簡単にアラインメントされ、その特性を特徴付けることができます。このような参照ベースのアセンブリは迅速かつ簡単ですが、新しい配列やコピー数の多い変異が「隠れる」という欠点があります。さらに、ほとんどの生物では参照ゲノムはまだ存在していません。

デノボアセンブリは、リファレンスアラインメントに代わるゲノムアセンブリ手法です。これは、生のシーケンスリードからゲノムシーケンス全体を再構築することを指します。この方法は、リファレンスゲノムがない場合、メタゲノミクスのように特定の生物の種が不明な場合、またはリファレンスゲノムアラインメントでは検出されない可能性のある対象の遺伝子変異が存在する場合に選択されます。

現在のシーケンシング技術によって生成される短いリードを考えると、de novo アセンブリは大きな計算上の問題です。通常、適切なオーバーラップを持つシーケンス リードを見つけて接続する反復プロセスによってアプローチされます。de bruijn グラフやオーバーラップ レイアウト コンセンサス グラフなどのさまざまな計算および統計手法が、この問題を解決するために活用されてきました。しかし、真核生物ゲノムの反復性が高いため、de novo アセンブリでゲノム配列を正確かつ完全に再構築することは依然として困難です。ペア エンド リードが可能な解決策として提案されていますが、正確なフラグメント長は不明な場合が多く、近似値を求める必要があります。^[7]

第 3 世代シーケンシングによって提供される長い読み取り長は、現在 de novo ゲノムアセンブリが直面している多くの課題を軽減する可能性があります。たとえば、反復領域全体を 1 回の読み取りで明確に配列できる場合、計算による推論は必要ありません。高いエラー率の問題を軽減するための計算方法が提案されています。たとえば、ある研究では、PacBio シーケンシングのみを使用した微生物ゲノムの de novo アセンブリが、第 2 世代シーケンシングよりも優れたパフォーマンスを発揮することが実証されました。^[8]

第三世代シーケンシングは第二世代シーケンシングと組み合わせて使用​​されることもあります。このアプローチはハイブリッドシーケンシングと呼ばれることもあります。たとえば、第三世代シーケンシングからの長いリードは、以前に第二世代シーケンシングを使用してアセンブルされたゲノムに存在する曖昧さを解決するために使用できます。一方、短い第二世代リードは、長い第三世代リードに存在するエラーを修正するために使用されています。一般に、このハイブリッドアプローチは、de novoゲノムアセンブリを大幅に改善することが示されています。^[9]

DNAメチル化（DNAm）は、 CpG部位でのDNAの共有結合修飾によってメチル基が付加される現象で、エピジェネティック機構の中で最もよく理解されている要素です。DNA修飾とそれに伴う遺伝子発現は、細胞の種類、時間的発達、遺伝的祖先によって異なり、環境刺激によって変化し、遺伝性があります。DNAmの発見後、研究者らは、がんや自閉症などの疾患との相関関係も発見しました。^[10]この疾患病因の文脈では、DNAmはさらなる研究の重要な手段です。

メチル化状態を調べるための現在最も一般的な方法では、イルミナプラットフォーム上で標準的な第二世代シーケンシングを行う前にDNAを断片化するアッセイが必要です。読み取り長が短いため、メチル化の長いパターンに関する情報が失われます。^[5]第三世代シーケンシング技術は、長い読み取りの単一分子リアルタイムシーケンシング機能を提供し、前述のアッセイなしでDNA修飾を検出します。^[11]

オックスフォードナノポアテクノロジーのMinION はDNAm の検出に使用されています。各 DNA 鎖が細孔を通過すると、ヌクレオチドのエピジェネティックな変化に敏感であることがわかっている電気信号が生成され、隠れマルコフモデル(HMM) を使用して MinION データを分析して5-メチルシトシン(5mC) DNA 修飾を検出しました。^{[5]このモデルは、合成メチル化}大腸菌DNA を使用してトレーニングされ、結果として得られた信号がナノポア技術によって測定されました。次に、トレーニングされたモデルを使用して、参照メチロームがすでに存在するヒト細胞株からの MinION ゲノム読み取りで 5mC を検出しました。この分類器は、ランダムにサンプリングされたシングルトンサイトで 82% の精度を示し、より厳しいしきい値を適用すると 95% に向上します。^[5]

MinIONプラットフォームを使用して、他の方法では、さまざまな種類のDNA修飾に対処します。Stoiberらは、5mCに加えて4-メチルシトシン（4mC）と6-メチルアデニン（6mA）を調べ、生のMinIONデータを人間に優しい方法で直接視覚化するソフトウェアも作成しました。^[12]ここで、彼らは、既知のメチロームを持つ大腸菌では、5塩基対の長さのイベントウィンドウを使用して、生のMinION電気信号を分割して統計的に分析できることを発見しました。簡単なマンホイットニーU検定で、大腸菌配列の修飾部分を検出できるだけでなく、修飾を4mC、6mA、または5mC領域にさらに分割できます。^[12]

将来的には、MinION の生データが DNA 内のさまざまなエピジェネティック マークの検出に使用されるようになると思われます。

PacBioシーケンシングは DNA メチル化の検出にも使用されています。このプラットフォームでは、パルス幅 (蛍光パルスの幅) が特定の塩基に対応しています。2010 年には、コントロール サンプルとメチル化サンプルのパルス間距離が異なり、メチル化タイプごとに「シグネチャー」パルス幅があることが示されました。^{[11] 2012 年には、PacBio プラットフォームを使用して DNA}メチルトランスフェラーゼの結合部位が特徴付けられました。^[13] C Elegansの N6 メチル化の検出は2015 年に示されました。^[14 ] 2016 年には、 PacBio プラットフォームを使用してマウス胚性幹細胞のN ⁶アデニンの DNA メチル化が示されました。^[15]

重金属、酸化、紫外線による損傷などによる他の形態の DNA 修飾も、オックスフォード ナノポアと PacBio の第 3 世代シーケンシングを使用した研究の手段となる可能性があります。

MinION生データでは、生データの処理（中央値信号への正規化など）が必要であり、テクノロジーのリアルタイム機能が低下しました。^[12]電気信号の一貫性は依然として問題であり、ヌクレオチドを正確に呼び出すことが困難です。MinIONはスループットが低く、複数の重複する読み取りを取得することが難しいため、下流のDNA修飾検出の精度の問題につながります。MinION生データで使用される隠れマルコフモデルと統計的手法はどちらも、検出のためにDNA修飾を繰り返し観察する必要があり、つまり、個々の修飾ヌクレオチドは、サンプル内の複数の細胞やプラスミドなど、ゲノムの複数のコピーに一貫して存在する必要があることを意味します。

PacBio プラットフォームの場合も、どのようなメチル化を見つけるかによって、必要なカバレッジは異なります。2017 年 3 月現在、ヒストン修飾などの他のエピジェネティック要因は、第 3 世代のテクノロジーでは検出できません。より長いメチル化パターンは、より小さなコンティグを組み立てる必要があるため、失われることがよくあります。

トランスクリプトミクスはトランスクリプトームの研究であり、通常は研究対象の組織におけるメッセンジャーRNA分子の相対的存在量を特徴づけることによって行われます。分子生物学のセントラルドグマによれば、遺伝情報は二本鎖DNA分子から一本鎖mRNA分子に流れ、そこで機能的なタンパク質分子に容易に翻訳されます。トランスクリプトームを研究することで、遺伝子発現の調節に関する貴重な洞察を得ることができます。

第二世代のシーケンシングでは発現レベルを多かれ少なかれ正確に描写できるが（転写産物の実際の存在量はランダムにサンプリングされていると想定できる）、転写産物レベルの情報は依然として重要な課題である。^[16]結果として、分子生物学における選択的スプライシングの役割は依然としてほとんど解明されていない。第三世代のシーケンシング技術は、mRNA分子の全長のシーケンシングを可能にすることで、この問題を解決する有望な可能性を秘めている。

選択的スプライシング（AS）は、単一の遺伝子から複数の異なるmRNA転写産物が生成され、その結果、異なるタンパク質翻訳が生​​じるプロセスです。^[17] ASは普遍的な現象であり、特に複雑な真核生物において生物の表現型を決定する上で重要な役割を果たしている可能性があることを示す証拠があります。すべての真核生物には、ASを受ける可能性のあるイントロンからなる遺伝子が含まれています。特に、ASはすべてのヒトのマルチエクソン遺伝子の95％で発生すると推定されています。^[18] ASは、無数の生物学的プロセスに影響を及ぼす可能性を否定できません。この分野での知識の進歩は、生物学の研究全般に重要な意味を持ちます。

現在の世代のシーケンシング技術では短いリードしか生成されないため、異なる転写産物を検出する能力に大きな制限があります。短いリードは、結果として生じるリード観察を生じさせた可能性のある元の転写産物にリバースエンジニアリングする必要があります。^[19]このタスクは、転写産物間での発現レベルが大きく変動し、その結果、遺伝子の配列全体でリードカバレッジが変動するため、さらに複雑になります。^[19]さらに、エクソンは個々の転写産物間で共有されている場合があり、明確な推論が実質的に不可能になります。^[17]既存の計算方法は、多くの場合、単純化した仮定を立てることで、さまざまな配列位置での短いリードの蓄積に基づいて推論を行います。^[19] Cufflinks は、可能な限り少ない数の転写産物ですべてのリードを説明しようとする、倹約的なアプローチを採用しています。^[20]一方、StringTie は、リードをアセンブルしながら同時に転写産物の存在量を推定しようとします。^[19]これらの方法は合理的ではありますが、必ずしも実際の転写産物を識別できるとは限りません。

2008年に発表された研究では、25種類の既存の転写産物再構成プロトコルを調査しました。^[16]その証拠は、既存の方法は一般的に転写産物の組み立てが弱いが、個々のエクソンを検出する能力は比較的健全であることを示唆しています。 ^[16]推定によると、25のプロトコル全体でエクソンを検出する平均感度は、 Caenorhabditis elegans遺伝子で80%です。^[16]比較すると、転写産物識別感度は65%に低下します。ヒトの場合、この研究ではエクソン検出感度が平均69%、転写産物検出感度が平均わずか33%であると報告されています。^[16]言い換えれば、ヒトの場合、既存の方法では存在する転写産物の半分以下しか識別できません。

第三世代のシーケンシング技術は、転写産物の検出と転写産物レベルでのmRNA存在量の推定の問題を解決する上で有望な見通しを示しています。エラー率は依然として高いものの、第三世代のシーケンシング技術ははるかに長い読み取り長を生成する能力を持っています。^[21] Pacific Bioscienceは、mRNA分子を全長でシーケンシングすることを提案するiso-seqプラットフォームを導入しました。^[21] Oxford Nanoporeも同様の技術を提案すると予想されています。エラー率が高いという問題は、補足的な高品質の短い読み取りによって軽減される可能性があります。このアプローチは以前にテストされており、エラー率を3倍以上削減することが報告されています。^[22]

メタゲノミクスは、環境サンプルから直接回収された遺伝物質を分析することです。

メタゲノミクスにおける第 3 世代シーケンシング技術の主な利点は、第 2 世代の技術と比較したシーケンシングの速度です。シーケンシングの速度は、たとえば臨床現場 (病原体の特定など) で、効率的な診断とタイムリーな臨床処置を可能にするために重要です。

オックスフォードナノポアのMinIONは、2015年に複雑でバックグラウンドの高い臨床サンプル中の病原体のリアルタイムメタゲノム検出に使用されました。最初のエボラウイルス（EBOV）の読み取りは、データ取得後44秒でシーケンスされました。^[23]読み取りはゲノムに均一にマッピングされ、少なくとも1つの読み取りがゲノムの88％以上にマッピングされました。比較的長い読み取りにより、一次臨床サンプルから直接、ほぼ完全なウイルスゲノムを高精度（97〜99％の同一性）でシーケンスすることができました。^[23]

微生物群集の多様性研究における一般的な系統マーカーは、16SリボソームRNA遺伝子である。この遺伝子の配列決定には、MinIONとPacBioのSMRTプラットフォームの両方が使用されている。^{[24] [25]}この文脈では、PacBioのエラー率は、454およびIlluminaのMiSeqシーケンシングプラットフォームからの短い読み取りのエラー率と同等であった。^{[引用が必要]}

MinION のエラー率が高い (~10-40%)ため、一塩基分解能が必要な抗菌薬耐性マーカーの特定ができませんでした。同じ理由で、真核病原体も特定されませんでした。^[23]同じフローセルを再利用する場合の持ち越し汚染の容易さ (標準的な洗浄プロトコルは機能しません) も懸念事項です。固有のバーコードにより、より多くの多重化が可能になります。さらに、細菌、真菌、寄生虫の正確な種の特定は非常に困難です。これらはゲノムの大部分を共有しており、中には 5% 未満しか違わないものもあります。

塩基配列決定コストは、MiSeqよりも依然として大幅に高い。しかし、サンガー法の検出限界以下の生物の全長配列を参照データベースに追加できる可能性はあり、^[24]これはメタゲノミクスにおける生物の同定に大きく役立つ可能性がある。

• 第一世代シーケンシング
• 第二世代シーケンシング

•  マルクス、ヴィヴィアン（2023年1月12日）。「今年の手法：ロングリードシーケンシング」。ネイチャーメソッド。20 （1）：6–11。doi ：10.1038 /s41592-022-01730- w。ISSN 1548-7105。PMID 36635542  。