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バイオインフォマティクスにおいて、DNAリードエラーとは、シーケンスアセンブラがDNAの塩基を別の塩基に置き換えてしまう場合に発生するエラーのことである。シーケンスアセンブラから得られたリードデータを用いてデ・ブルイングラフを作成し、様々な方法でエラー検出に利用できる。
デ・ブルイングラフでは、ゲノムの配置を構成するために 4^k 通りの異なるノードが存在する可能性があります。グラフを作成するために使用されるノードの数は、対象となるDNA鎖内で見つかったk-merのみを考慮することで削減できます。配列 1 が与えられた場合、グラフに含まれるサイズ 7 のノード、つまり 7-mer を決定することができます。これらの 7-mer によって、図 1 に示すグラフが作成されます。[ 1 ]
図 1 に示すグラフは、グラフがどのようなものになるかを示す非常に単純なバージョンです。[ 2 ]このグラフは、7-mer の最後の 6 要素を取り出し、最初の 6 要素が同じノードにリンクすることによって形成されます。図 1 は、各ノードに正確に 1 つの入力パスと 1 つの出力パスがあるため、デ ブルイン グラフとして最も単純なものです。ほとんどの場合、グラフには、ノードに向かう複数のエッジ、および/またはノードから出る複数のエッジがあります。これは、ノードの接続方法によって発生します。k-mer の最後の k-1 要素が任意のノードの最初の k-1 要素と一致する場合、ノードを指すエッジによってノードが接続されます。これにより、多重エッジデ ブルイン グラフが形成されます。このようなより複雑なグラフは、読み取りエラーまたは DNA 鎖のバリエーションによって発生します。どちらの原因も、DNA の正しい構造と、違いの原因を特定することを困難にします。ほとんどのDNA鎖には読み取りエラーや変異が含まれる可能性が高いため、科学者たちは、エラーによって生成された頂点やエッジが除去された後、明確に接続されたグラフのノードを統合できるアセンブリプロセスを使用することを望んでいる。[ 3 ]
シーケンスデータからグラフを作成すると、読み取りエラーによって先端とバブルが形成されます。先端とは、シーケンス処理中にエラーが発生し、グラフが途中で終了した箇所であり、正しいk-merと誤ったk -merの両方が含まれます。バブルも、シーケンス読み取り処理中にエラーが発生した場合に形成されます。ただし、エラーが発生した場所に関わらず、k -merの読み取りがメイングラフに再接続し、何も起こらなかったかのように処理を続行できる経路が存在します。データから作成されたデ・ブルイングラフに先端とバブルが存在する場合、先端またはバブルが出現した原因がエラーである場合にのみ、それらを削除できます。科学者が参照ゲノムを使用している場合、参照ゲノムのグラフとシーケンスのグラフを比較することで、先端の位置を迅速かつ容易に特定できます。参照ゲノムがない場合は、曖昧な点が見つかるまで枝を逆方向にたどることで先端が削除されます。先端は、先端を含む枝が設定された閾値よりも短い場合にのみ削除されます。[ 3 ]バブルを除去するプロセスは、もう少し複雑です。まず最初に行う必要があるのは、バブルの開始点を特定することです。そこから、バブルの開始点から各パスをたどり、再接続点まで確認します。再接続点はパスごとに異なる場合があります。開始ノードからさまざまな長さのパスが存在する可能性があるため、カバレッジが低いパスが削除されます。[ 3 ]
任意の長さの配列が与えられた場合、最初に行う必要がある手順は、その配列をシーケンスプログラムに入力し、シーケンスを行い、特定の長さの塩基対(bp) のリードを返すことです。完全に正確なシーケンスプログラムは存在しないため、常にエラーを含むリードがいくつか存在します。最も一般的なシーケンス方法はショットガン法であり、これは配列 2 で最も使用された方法である可能性が最も高いです。方法が決定したら、返される bp リードの長さを指定する必要があります。配列 2 の場合、7 bp のリードが返され、処理中に発生したすべてのエラーが赤色で示されました。[ 4 ]
リードが取得されると、それらはk -merにハッシュ化されます。次に、 k -merは、各リードに何回出現したかを示す表に記録されます。この例では、各リードは4 -merにハッシュ化され、エラーがあった場合は赤色で記録されました。その後、すべての4 -merが記録され、その出現頻度が次の表に示されています。
表の各セルはそれぞれノードとなり、与えられたk -mer からde Bruijn グラフを形成できます。図 2 では、直線状の領域が識別され、次に、直線状の領域が異なるk -mer サイズの単一のノードになった別のグラフ (図 3) が形成され、より簡潔なグラフになります。この簡略化されたグラフでは、図 4 に示すように、さまざまな先端とバブルを簡単に識別できます。これらのバブルと先端は、bp リードのエラーから形成されたことがわかっているため、これらを削除して、元の配列を正確かつ完全に反映するグラフ構造を得ることができます。[ 4 ]図 5 に示す de Bruijn グラフをたどると、形成された配列が、配列 2 で与えられた DNA 配列と確かに一致することがわかります。
2本のDNA鎖を比較する場合、エラーを特定するために色付きのデ・ブルイングラフがよく使用されます。これらのエラー（多くの場合、多型）は、前述のものと同様のバブルを形成します。現在、データを一般化してバブルの位置を特定するために使用される主なアルゴリズムが4つあります。4つのアルゴリズムは、グラフのノードとエッジを、それらが観察されたサンプルによって色付けできるようにすることで、デ・ブルイングラフを拡張します[ 5 ] 。
色付きデブルイングラフの最も単純な使用法は、バブルコールアルゴリズムとして知られています。このアルゴリズムは、元のゲノムと異なるゲノム上のバブルを探して特定します。これらのバブルは「クリーン」である必要があり、単に参照ゲノムからの分岐である必要があり、DNA塩基の欠失によって引き起こされるものであってはなりません。このアルゴリズムは、反復配列と変異によって誘発されたバブルを分離するのが難しいため、偽陽性率が高くなる可能性があります。ただし、信頼性を向上させるために参照ゲノムがしばしば存在します。参照ゲノムは変異の検出にも役立ち、変異部位を検出するために不可欠です。[ 5 ]最近、科学者たちは、コピー数変異検出とバブルコールアルゴリズムを使用する方法を発見し、将来的にこれらの変異を偏りなく検出する機会を可能にしました。 [ 6 ] [ 7 ]
複雑なバリアントを調べると、クリーンなコンティグになる可能性は非常に低い。これが最もよくあるケースであるため、パス分岐アルゴリズムは、特に欠失が発生する場所を考慮し、バリアントが非常に複雑で参照アレルに限定されている場合に有用である。バブルが形成されると、パス分岐アルゴリズムが最も頻繁に使用され、検出されたバブルを非常に体系的な手順で削除することができる。アルゴリズムはまず、各分岐点を特定する。次に、各分岐点から、バブルを形成するストランドをトレースして、nノード後に 2 つのパスが結合する場所を見つける。2 つのパスが結合する場合、カバレッジの低いパスが削除され、ファイルに保存される。[ 3 ] [ 8 ]
複数のサンプルを使用すると、変異の検出の検出力と偽陽性率が大幅に向上します。最も単純なケースでは、サンプルは単一の色のグループにまとめられ、データは前述のように分析されます。しかし、各サンプルセットごとに別々の色を維持することで、エラーによるものか繰り返しによるものかに関わらず、バブルがどのように形成されたかに関する追加情報が得られます。[ 5 ] 1997年、マサチューセッツ州フレイミングハムのジェンザイム・ジェネティクスの技術部門は、多重アレル特異的診断アッセイ（MASDA）を使用してバブルに対処する画期的な新しいアプローチを開発しました。このプログラムは、フォワードドットブロット、複雑な同時プローブハイブリダイゼーション、および直接変異検出を組み合わせて、複数のサンプル分析の二重の問題を解決するのに役立ちます。[ 9 ]
色付きのデ・ブルイングラフは、バリアントアセンブリに十分なカバレッジがない場合でも、既知の遺伝子座で任意のDNAサンプルをジェノタイピングするために使用できます。 [ 5 ]このプロセスの最初のステップは、参照アレル、既知のバリアント、およびサンプルからのデータのグラフを構築することです。次に、アルゴリズムは各ジェノタイプの尤度を計算し、局所的およびゲノム全体の配列の両方のグラフの構造を考慮します。これにより、複数のアレルタイプに一般化され、複雑な複合バリアントのジェノタイピングに役立ちます。[ 5 ]このアルゴリズムは、対処すべきバブルが形成されないため、頻繁に使用されます。また、これは、前述の3つのアルゴリズムのいずれよりも直接的に、遺伝子内のより複雑な問題を見つけるのに役立ちます。