単一分子リアルタイムシーケンシング

単一分子リアルタイム（SMRT）シーケンシングは、並列化された単一分子DNAシーケンシング法である。単一分子リアルタイムシーケンシングは、ゼロモード導波路（ZMW）を利用する。^[1]単一のDNAポリメラーゼ酵素が、テンプレートとして単一のDNA分子とともにZMWの底部に取り付けられている。ZMWは、DNAポリメラーゼによって組み込まれるDNAの単一のヌクレオチドのみを観察できるほど小さい照明観察体積を作成する構造である。4つのDNA塩基のそれぞれは、4つの異なる蛍光染料のいずれかに付着している。ヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって組み込まれると、蛍光タグが切断され、ZMWの観察領域から拡散し、その蛍光は観察されなくなる。検出器はヌクレオチドの組み込みの蛍光信号を検出し、染料の対応する蛍光に従って塩基呼び出しが行われる。^[2]

DNA の配列決定は、多数の ZMW を含むチップ上で行われます。各 ZMW の内部には、一本鎖 DNA テンプレートの分子 1 つを含む単一の活性 DNA ポリメラーゼが底部に固定されており、光が透過して可視化チャンバーを形成し、単一分子レベルで DNA ポリメラーゼの活動を監視できます。DNA ポリメラーゼによって取り込まれたリン酸化ヌクレオチドからの信号は、DNA 合成が進むにつれて検出され、リアルタイムで DNA の配列決定が行われます。

ライブラリを準備するには、ヘアピンアダプターライゲーションを使用してDNA断片を環状に並べます。^[3]

それぞれのヌクレオチド塩基には、DNA合成時にDNAポリメラーゼによって取り込まれる塩基を検出器が識別できるようにする対応する蛍光色素分子があります。蛍光色素分子はヌクレオチドのリン酸鎖に付着しています。ヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって取り込まれると、リン酸鎖とともに蛍光色素が切断されます。これは自然なDNA合成プロセスの一環であり、この過程でリン酸ジエステル結合が形成されてDNA鎖が伸長します。切断された蛍光色素分子は検出体積から拡散し、蛍光信号は検出されなくなります。^[4]

ゼロモード導波路（ZMW）は、透明なシリカ基板上に堆積されたアルミニウムクラッドフィルムの円形の穴で構成されるナノフォトニック閉じ込め構造である。 ^[5]

ZMWホールの直径は約70nm、深さは約100nmです。光が小さな開口部を通過する際の挙動により、チャンバー内で光場は指数関数的に減衰します。^{[6] [7]}

照明されたZMW内の観察容積は約20ゼプトリットル（20×10−21^リットル）である。この容積内では、単一のヌクレオチドを取り込むDNAポリメラーゼの活性を容易に検出することができる。^{[4] [8]}

シーケンシング性能は、読み取り長、精度、および実験あたりの総スループットで測定できます。ZMWを使用するPacBioシーケンシングシステムは読み取り長が長いという利点がありますが、エラー率は5〜15％程度で、サンプルスループットはIlluminaシーケンシングプラットフォームよりも低くなります。^[9]

2018 年 9 月 19 日、Pacific Biosciences [PacBio] は、化学バージョンとソフトウェア バージョンを同期させた Sequel 6.0 ケミストリーをリリースしました。高分子 DNA を含む大きなインサート ライブラリと、長さが約 15,000 塩基未満の短いインサート ライブラリのパフォーマンスを比較します。大きなテンプレートの場合、平均読み取り長は最大 30,000 塩基です。短いインサート ライブラリの場合、平均読み取り長は最大 100,000 塩基で、同じ分子を円で複数回読み取ります。後者の短いインサート ライブラリは、単一の SMRT セルから最大 500 億塩基を生成します。^[10]

パシフィックバイオサイエンス（PacBio）は、2010年後半にRS機器のベータ版をリリースした後、2011年にSMRTシーケンシングを商品化しました。 [11 ^{] [12]}

商業化時には、読み取り長は平均約1100塩基の正規分布を示していました。2012年初頭にリリースされた新しい化学キットでは、シーケンサーの読み取り長が増加しました。この化学キットの初期の顧客は、平均読み取り長が2500～2900塩基であると述べています。^[13]

2012年後半にリリースされたXL化学キットでは、平均読み取り長が4300塩基以上に増加しました。^{[14] [15]}

2013 年 8 月 21 日、PacBio は新しい DNA ポリメラーゼ バインディング キット P4 をリリースしました。この P4 酵素は、C2 シーケンシング ケミストリーと組み合わせると平均読み取り長が 4,300 塩基以上、XL ケミストリーと組み合わせると 5,000 塩基以上になります。^[16]この酵素の精度は C2 と同様で、30 倍から 40 倍の範囲で QV50 に達します。結果として得られる P4 属性により、SMRT セルの数を減らして、バリアント呼び出しを改善した高品質のアセンブリが実現しました。^[16]入力 DNA サイズ選択 (BluePippin などの電気泳動装置を使用) と組み合わせると、平均読み取り長は 7 キロベース以上になります。^[17]

2013年10月3日、PacBioはPacBio RS II用の新しい試薬の組み合わせ、C3ケミストリーを備えたP5 DNAポリメラーゼ（P5-C3）をリリースしました。これらを組み合わせることで、シーケンシングの読み取り長が平均約8,500塩基に延長され、最長の読み取りは30,000塩基を超えます。^[18] SMRT細胞あたりのスループットは、CHM1細胞株のシーケンシング結果によって実証された約5億塩基です。^[19]

2014年10月15日、PacBioはRS IIシステム用の新しいケミストリーP6-C4のリリースを発表しました。これは同社の第6世代ポリメラーゼと第4世代ケミストリーに相当し、平均読み取り長が10,000～15,000塩基にさらに拡張され、最長読み取りは40,000塩基を超えます。新しいケミストリーのスループットは、シーケンスするサンプルに応じて、SMRTセルあたり5億～10億塩基と推定されました。^{[20] [21]}これはRS機器用にリリースされたケミストリーの最終バージョンでした。

この技術の実験あたりのスループットは、配列されたDNA分子の読み取り長さとSMRTセルの総マルチプレックスの両方に影響されます。SMRTセルのプロトタイプには、並列DNA配列を可能にする約3000個のZMWホールが含まれていました。商品化時には、SMRTセルにはそれぞれ150,000個のZMWホールがパターン化され、75,000個の2セットで読み取られました。^[22] 2013年4月、同社は「PacBio RS II」と呼ばれるシーケンサーの新バージョンをリリースしました。これは、150,000個のZMWホールをすべて同時に使用し、実験あたりのスループットを2倍にします。^{[23] [24]} 2013年11月の最高スループットモードでは、P5結合、C3ケミストリー、BluePippinサイズ選択が使用され、PacBio RS IIは公式にはSMRTセルあたり3億5000万塩基を生成しましたが、ヒトのde novoデータセットでは、平均5億塩基のケミストリーがSMRTセルあたりに生成されました。スループットは、シーケンスされるサンプルの種類によって異なります。^[25] P6-C4ケミストリーの導入により、SMRTセルあたりの典型的なスループットは5億塩基から10億塩基に増加しました。

2015年9月、同社は容量を100万ZMWの穴に増加させた新しいシーケンシング装置「Sequel System」の発売を発表しました。^{[26] [27]}

Sequel 機器では、初期の読み取り長さは RS と同等でしたが、その後の化学リリースにより読み取り長さが増加しました。

2017年1月23日、V2ケミストリーがリリースされました。これにより、平均読み取り長が10,000～18,000塩基に増加しました。^[28]

2018年3月8日、2.1ケミストリーがリリースされました。平均リード長は20,000塩基に増加し、全リードの半分が30,000塩基以上になりました。SMRTセルあたりの収量は、大きなインサートライブラリまたは短いインサート（アンプリコンなど）ライブラリのいずれかで、それぞれ100億または200億塩基に増加しました。^[29]

同社は2018年9月19日、平均読み取り長が短い挿入ライブラリでは10万塩基、長い挿入ライブラリでは3万塩基に増加したSequel 6.0ケミストリーを発表しました。SMRT Cellの収量は、短い挿入ライブラリで最大500億塩基に増加しました。^[10]

2019年4月、同社は800万ZMWの新しいSMRTセルをリリースし、^[30] SMRTセルあたりの予想スループットを8倍に増加させました。^[31] 2019年3月の早期アクセス顧客は、約15kbの長さのテンプレートを使用した58の顧客実行セルでセルあたり250GBの生の収量、より重い分子のテンプレートを使用したセルあたり67.4GBの収量のスループットを報告しました。^[32]システムパフォーマンスは現在、高分子量連続ロングリードまたは事前補正済みHiFi（Circular Consensus Sequence（CCS）とも呼ばれる）リードで報告されています。高分子量リードの場合、すべてのリードの約半分が50kbより長くなっています。

HiFi パフォーマンスには、修正のために繰り返しアンプリコン パスを使用して、Phred スコア Q20 を超える品質の修正済み塩基が含まれます。これには、最大 20kb の長さのアンプリコンが含まれます。

単一分子のリアルタイムシーケンスは、幅広いゲノミクス研究に適用できる可能性があります。

デノボゲノムシーケンシングの場合、単一分子リアルタイムシーケンシングからの読み取り長は、ジデオキシヌクレオチド鎖終結に基づくサンガーシーケンシング法からの読み取り長と同等かそれ以上です。読み取り長が長いため、デノボゲノムシーケンシングが可能になり、ゲノムアセンブリが容易になります。^{[2] [33] [34]}科学者はまた、デノボゲノムのハイブリッドアセンブリで単一分子リアルタイムシーケンシングを使用して、短い読み取りシーケンスデータと長い読み取りシーケンスデータを組み合わせています。^{[35] [36]} 2012年には、細菌ゲノムの自動仕上げを実証する査読済みの出版物がいくつか発表されました。 ^{[37] [38]}その中には、長いSMRTシーケンシングリードを使用してゲノム仕上げ用のパイプラインでCelera Assemblerを更新した論文も含まれています。^[39] 2013年に科学者たちはロングリードシークエンシングが細菌と古細菌のゲノムの大部分を完全に組み立てて完成させるために使用できると推定した。^[40]

同じDNA分子は、環状DNAテンプレートを作成し、新しく合成されたDNA鎖をテンプレートから分離する鎖置換酵素を利用することで、独立して再配列することができます。^[41] 2012年8月、ブロード研究所の科学者は、SNP呼び出しのためのSMRTシーケンシングの評価を発表しました。^[42]

ポリメラーゼのダイナミクスは、塩基がメチル化されているかどうかを示します。^[43]科学者は、メチル化やその他の塩基修飾を検出するために、単一分子リアルタイムシーケンシングの使用を実証しました。^{[44] [45] [46]} 2012年に、科学者チームはSMRTシーケンシングを使用して、6つの細菌の完全なメチロームを生成しました。^[47] 2012年11月、科学者は大腸菌のアウトブレイク株のゲノム全体のメチル化に関するレポートを発表しました。^[48]

ロングリードにより、5'末端と3'末端を含む完全な遺伝子アイソフォームの配列決定が可能になります。このタイプの配列決定は、アイソフォームとスプライスバリアントを捕捉するのに役立ちます。^{[49] [50]}

SMRTシーケンシングは、生殖医学遺伝学研究において、親の性腺モザイクが疑われる家族を調査する際に、いくつかの用途がある。長い読み取りにより、患者のハプロタイプフェージングが可能になり、突然変異の親起源を調査することができる。ディープシーケンシングにより、精子細胞内の対立遺伝子頻度の決定が可能になり、将来の罹患子孫の再発リスクの推定に関連性がある。^{[51] [52]}

• BioIT World.com からのレポート
• ニューヨークタイムズのレポート