単一分子リアルタイムシーケンシング

ライブラリーを準備するために、DNA断片はヘアピンアダプターライゲーションを使用して環状に配置される。^{[ 3 ]}

各ヌクレオチド塩基には対応する蛍光色素分子があり、検出器はDNAポリメラーゼがDNA合成を行う際に取り込まれる塩基を識別することができます。蛍光色素分子はヌクレオチドのリン酸鎖に結合しています。ヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって取り込まれると、 DNA鎖を伸長するためにホスホジエステル結合が形成される自然なDNA合成プロセスの一部として、蛍光色素はリン酸鎖とともに切断されます。切断された蛍光色素分子は検出領域から拡散するため、蛍光信号は検出されなくなります。^{[ 4 ]}

ゼロモード導波路（ZMW）は、透明なシリカ基板上に堆積されたアルミニウムクラッド膜に円形の穴が開けられたナノフォトニック閉じ込め構造である。 ^{[ 5 ]}

ZMWの穴は 直径約70 nm、 深さ約100 nmです。光が小さな開口部を通過する際の挙動により、光場はチャンバー内で指数関数的に減衰します。^{[ 6 ] [ 7 ]}

照明された ZMW 内の観察体積は約 20 ゼプトリットル (20 × 10⁻²¹^リットル) です。観察体積が非常に小さいため、溶液中に存在する遊離した未結合の蛍光ヌクレオチドからのバックグラウンド蛍光が排除されます。この体積内では、各ヌクレオチドが異なる色であるため、単一のヌクレオチドを取り込む DNA ポリメラーゼの活性を容易に検出できます。^{[ 4 ] [ 8 ]}

商業化の時点では、リード長は平均約1100塩基の正規分布を示していた。2012年初頭に発売された新しい化学キットによりシーケンサーのリード長が増加し、その化学キットの初期の顧客は平均リード長が2500～2900塩基であると報告した。^{[ 13 ]}

2012年後半に発売されたXLケミストリーキットは、平均リード長を4300塩基以上に伸ばしました。^{[ 14 ] [ 15 ]}

2013 年 8 月 21 日、PacBio は新しい DNA ポリメラーゼ Binding Kit P4 をリリースしました。この P4 酵素は、C2 シーケンス ケミストリーと組み合わせると平均 4,300 塩基以上、XL ケミストリーと組み合わせると 5,000 塩基以上のリード長を実現します。^{[ 16 ]}この酵素の精度は C2 と同程度で、30 倍から 40 倍のカバー率で QV50 に達します。結果として得られる P4 の特性により、より少ない SMRT セルを使用し、バリアント コールを改善して、より高品質のアセンブリが実現しました。^{[ 16 ]}入力 DNA サイズの選択 (BluePippin などの電気泳動装置を使用) と組み合わせると、平均リード長は 7 キロベースを超えます。^{[ 17 ]}

2013年10月3日、PacBioはPacBio RS II用の新しい試薬の組み合わせ、C3ケミストリーを備えたP5 DNAポリメラーゼ（P5-C3）をリリースしました。これらを組み合わせることで、シーケンスリード長を平均約8,500塩基まで延長し、最長リードは30,000塩基を超えます。^{[ 18 ]} SMRTセルあたりのスループットは、CHM1細胞株のシーケンス結果で示されているように、約5億塩基です。^{[ 19 ]}

2014年10月15日、PacBioはRS IIシステム用の新しい化学P6-C4のリリースを発表しました。これは同社の第6世代ポリメラーゼと第4世代化学を表し、平均リード長を10,000～15,000塩基にさらに拡張し、最長リードは40,000塩基を超えます。新しい化学でのスループットは、シーケンスされるサンプルに応じて、SMRTセルあたり5億～10億塩基と推定されました。^{[ 20 ] [ 21 ]}これはRS機器用にリリースされた化学の最終バージョンでした。

この技術の実験あたりのスループットは、配列決定されたDNA分子の読み取り長とSMRTセルの総マルチプレックスの両方に影響されます。SMRTセルのプロトタイプには、並列DNAシーケンスを可能にする約3000個のZMWホールが含まれていました。製品化時には、SMRTセルはそれぞれ150,000個のZMWホールでパターン化され、75,000個の2つのセットで読み取られました。^{[ 22 ]} 2013年4月、同社は150,000個のZMWホールすべてを同時に使用し、実験あたりのスループットを2倍にした「PacBio RS II」と呼ばれる新しいバージョンのシーケンサーをリリースしました。^{[ 23 ] [ 24 ]} 2013 年 11 月の最高スループット モードでは、P5 結合、C3 化学、BluePippin サイズ選択、および PacBio RS II が使用され、公式には SMRT セルあたり 3億 5000 万塩基が得られましたが、化学を使用してリリースされたヒトde novoデータセットでは、SMRT セルあたり平均 5億塩基が得られました。スループットは、シーケンスされるサンプルの種類によって異なります。^{[ 25 ]} P6-C4 化学の導入により、SMRT セルあたりの典型的なスループットは 5億塩基から 10億塩基に増加しました。

2015年9月、同社は容量を100万ZMW穴に拡張した新しいシーケンス装置であるSequel Systemの発売を発表した。^{[ 26 ] [ 27 ]}

Sequel装置では、初期の読み取り長はRSと同程度でしたが、その後の化学反応のアップデートにより読み取り長が増加しました。

2017年1月23日、V2ケミストリーがリリースされました。これにより、平均リード長が10,000～18,000塩基に増加しました。^{[ 28 ]}

2018年3月8日、2.1ケミストリーがリリースされました。平均リード長が20,000塩基に増加し、リードの半分が30,000塩基以上の長さになりました。SMRTセルあたりの収量は、大きなインサートライブラリまたは短いインサート（アンプリコンなど）ライブラリでそれぞれ100億または200億塩基に増加しました。^{[ 29 ]}

2018年9月19日、同社はSequel 6.0ケミストリーを発表し、平均リード長が短いインサートライブラリで100,000塩基、長いインサートライブラリで30,000塩基に増加した。SMRT Cellの収量は、短いインサートライブラリで最大500億塩基に増加した。^{[ 10 ]}

2019 年 4 月、同社は 800 万 ZMW を搭載した新しい SMRT Cell をリリースし^{[ 30 ]} 、 SMRT Cell あたりの期待スループットを 8 倍に増加させました^{[ 31 ]} 。2019年 3 月の早期アクセス顧客は、長さ約 15 kb のテンプレートを使用した場合、セルあたり 250 GB の生データ収量、より高分子量の分子のテンプレートを使用した場合、セルあたり 67.4 GB の収量という 58 個の顧客実行セルのスループットを報告しました^{[ 32 ]} 。システムのパフォーマンスは現在、高分子量連続ロングリードまたは事前補正 HiFi (Circular Consensus Sequence (CCS) とも呼ばれる) リードのいずれかで報告されています。高分子量リードの場合、すべてのリードの約半分は 50 kb より長いです。

HiFi性能には、PhredスコアQ20以上の品質を持つ補正済み塩基が含まれており、補正にはアンプリコンの繰り返し処理が用いられます。これには最大20kbの長さのアンプリコンが対応します。