極低温電子トモグラフィー

極低温電子トモグラフィー（cryoET）は、高解像度（約1〜4 nm）のサンプルの3次元体積を再構築するために使用される画像化技術であり、多くの場合（ただしこれらに限定されないが）、生物学的高分子や細胞です。^{[1] [2] cryoETは}透過型電子顕微鏡（CryoTEM）の特殊な応用であり、サンプルを傾斜させて画像化し、一連の2D画像を組み合わせて、人体のCTスキャンに似た3D再構成を作成できます。他の電子トモグラフィー技術とは対照的に、サンプルは極低温条件（<-150°C）で画像化されます。細胞材料の場合、構造は非結晶性のガラス質の氷で固定されるため、生物学的構造を破壊または歪ませる脱水または化学的固定を行わずに画像化できます。^{[3] [4]}

電子顕微鏡法(EM)では、サンプルは高真空で画像化されます。このような真空は細胞などの生物学的サンプルには適していません。水分が蒸発し、圧力差で細胞が爆発してしまうからです。そのため、室温 EM 技術では、サンプルは固定と脱水によって準備されます。しかし、生物学的サンプルを安定化させるもう 1 つの方法は、サンプルを凍結することです (クライオ電子顕微鏡法またはクライオ EM)。他の電子クライオ顕微鏡法と同様に、クライオ ET のサンプル (通常は細菌、古細菌、ウイルスなどの小さな細胞) は標準的な水性媒体で準備され、EM グリッドに適用されます。次に、グリッドを極低温物質 (通常は液体エタン) に効率的に浸すため、水分子 が結晶格子に再配置される時間がありません。^{[3]結果として生じる水の状態は「ガラス質氷」と呼ばれ、通常凍結によって破壊される}脂質膜などの天然の細胞構造が保存されます。プランジ凍結されたサンプルは、その後、保管および撮影の間、水が結晶化するほど温まらないように 液体窒素の温度で維持されます。

サンプルは透過型電子顕微鏡（TEM）で画像化されます。他の電子トモグラフィー技術と同様に、サンプルは電子ビームに対して異なる角度（通常は約-60°から+60°まで1度または2度ごと）に傾斜し、各角度で画像が取得されます。^[5]この傾斜した一連の画像は、計算によって再構成され、対象物の3次元ビューになります。^[6]これはトモグラム、またはトモグラフィー再構成と呼ばれます。

クライオETの最もよく挙げられる利点の1つは、結晶学的方法や単粒子解析などの他のクライオEMイメージング方法でサンプルの複数のコピーを必要とするのではなく、個々のオブジェクト（タンパク質、細胞など）の3Dボリュームを再構築できることです。^[7]クライオETは、プランジ凍結によりサンプルが十分に速く所定の位置に固定され、原子の配置の変化が最小限に抑えられるため、摂動を受けていない細胞やその他のシステムに使用する場合、in situ法であると考えられています。 ^[8]

透過型電子顕微鏡（TEM）では、電子が物質と強く相互作用するため、複数の弾性散乱イベントによってサンプルが暗くならないように、サンプルを非常に薄く保つ必要があります。したがって、クライオETでは、サンプルの厚さは通常約500 nm未満です。このため、ほとんどのクライオET研究は、精製された高分子複合体、ウイルス、または多くの細菌や古細菌の種のものなどの小さな細胞に焦点を当ててきました。^{[1]たとえば、クライオETは、60 nmサイズのウイルスのようなナノ粒子内の12 nmサイズの}タンパク質ケージナノ粒子のカプセル化を理解するために使用されています。^[9]

より大きな細胞や組織でさえも、クライオセクショニングまたは集束イオンビーム（FIB）ミリングによって薄くすることでクライオET用に準備することができます。クライオセクショニングでは、凍結した細胞または組織のブロックをクライオミクロトームで薄いサンプルに切断します。^{[11] FIBミリングでは、プランジ凍結サンプルを集束イオンビーム（通常は}ガリウム）にさらし、サンプルの上部と下部から材料を正確に削り取り、クライオETイメージングに適した薄いラメラを残します。^[12]

1つまたは複数の断層像に複数のコピーが存在する構造の場合、サブ断層像の平均化によって、より高い解像度（1 nm以下）を得ることができます。^{[13] [14]}単一粒子解析と同様に、サブ断層像の平均化では、同一の物体の画像を計算的に組み合わせて、信号対雑音比を高めます。

電子顕微鏡法は、材料科学や物理学のサンプルと比較して、放射線損傷により生物学的サンプルを急速に劣化させることが知られています。^[15]生物学的サンプルを画像化する他のほとんどの電子顕微鏡法では、多くの異なるサンプルコピーからの信号を組み合わせることが、この問題を克服する一般的な方法でした（例：結晶学、単粒子分析）。クライオETでは、異なるサンプルコピーの画像を多数撮影する代わりに、1つの領域の画像をたくさん撮影します。その結果、サンプルのフルエンス（単位面積あたりに付与される電子の数）は、単粒子分析よりも約2〜5倍多くなります。^[16]はるかに弾力性のある材料のトモグラフィーでは、一般的な生物学的画像化よりも大幅に高い解像度が可能になるため、放射線損傷が生物学的サンプルのクライオETの最大の制限であることが示唆されます。^{[7] [17]}

電子と物質の強い相互作用は、異方性解像度効果ももたらします。画像化中にサンプルが傾くと、電子ビームは顕微鏡の光軸に沿って、より高い傾斜角でより厚い見かけのサンプルと相互作用します。実際には、約 60 ～ 70° を超える傾斜角では多くの情報が得られないため、使用されません。その結果、最終的な断層画像で情報の「欠落」が生じ、電子ビームと平行な解像度が低下します。^[6]

「欠けたウェッジ」という用語は、サンプルを 90° に傾けていないために空のウェッジが現れる、断層像のフーリエ変換の見方に由来しています。欠けたウェッジは、失われた情報がほとんど Z 軸に沿っているため、サンプル深度の解像度が不足します。欠けたウェッジは3D 電子結晶構造解析でも問題となり、通常は互いに重なり合う複数のデータセットをマージするか、可能な場合は対称性拡張によって解決されます。^[15]これらの解決策は両方とも結晶構造解析の性質によるものであり、どちらも断層像には適用できません。

クライオETにおける大きな障害は、複雑な細胞環境内で関心のある構造を特定することです。相関クライオ蛍光光学顕微鏡法^[19]や超解像光学顕微鏡法（例えば、クライオPALM ^[20] ）などのソリューションをクライオETと統合することができます。これらの技術では、蛍光タグ付きの関心のあるタンパク質を含むサンプルを急速凍結し、サンプルを結晶化温度未満（< -150 °C）に保つための特別なステージを備えた光学顕微鏡で最初に画像化します。蛍光信号の位置が特定され、サンプルはクライオTEMに転送され、そこで同じ位置がクライオETによって高解像度で画像化されます。

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• クライオ電子顕微鏡入門コース（カリフォルニア工科大学）