DARPin

DARPins（designed ankyrin repeat proteinsの頭文字）は、遺伝子操作された抗体模倣タンパク質であり、通常、標的タンパク質に非常に特異的かつ高親和性で結合します。これらは、細胞シグナル伝達、調節、細胞の構造的完全性など、さまざまな機能に関与する、自然界で最も一般的な結合タンパク質のクラスの1つである天然のアンキリンリピートタンパク質から派生しています。DARPinsは、少なくとも3つのリピートモチーフまたはモジュールで構成されており、最もN末端側と最もC末端側のモジュールは、タンパク質の疎水性コアを遮蔽するため、「キャップ」と呼ばれます。内部モジュールの数は番号（例：N1C、N2C、N3C、…）で示され、キャップはそれぞれ「N」または「C」で示されます。4つのリピート（N2C）または5つのリピート（N3C）を持つDARPinsの分子量は、例えば14または18 kDa（キロダルトン）であり、生物学的製剤としてはかなり小さいです（ IgGのサイズの約10% ）。 

DARPinは、強力で特異的かつ汎用性の高い小型タンパク質治療薬の新しいクラスを構成し、さまざまな研究、診断、治療用途における調査ツールとして使用されています。^{[ 1 ]}臨床段階のバイオ医薬品企業であるMolecular Partners AGは、複数のDARPin分子を臨床および前臨床開発中で、現在、自社開発とパートナーとの並行開発の両方を通じて治療用DARPinの開発を進めています。Athebio AGは、パートナーシップモデルのアプローチのためにDARPinの足場をさらに改良することに重点を置いています。^{[ 2 ]}

さらに、DARPinsは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）を含む可溶性タンパク質および膜タンパク質の結晶化シャペロンとして、結合パートナーとして、または標的タンパク質への強固な融合体として使用でき、この概念は現在、クライオEMによる構造決定にまで拡張されている。^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

DARPinプラットフォームは、スイスのチューリッヒ大学のアンドレアス・プリュックトゥーンの研究室で、組換え抗体の工学とライブラリーの研究中に発見され開発されました。^{[ 7 ]} DARPinは、自然界で高親和性のタンパク質間相互作用を媒介するタンパク質クラスである天然のアンキリンタンパク質から派生しています。

DARPinライブラリーは、数千個の天然アンキリンリピートモチーフ（それぞれ約33アミノ酸）の配列アライメントと、構造ベースの設計および組換えDNA法を組み合わせて設計されました。^{[ 7 ]}これらのタンパク質は、大きな潜在的標的相互作用面を持つ安定したタンパク質ドメインを形成する反復構造単位から構成されています。通常、DARPinは4つまたは5つのリピートから構成され、最初の（Nキャッピングリピート）と最後の（Cキャッピングリピート）は、疎水性タンパク質コアを水性環境から遮蔽する役割を果たします。DARPinは、天然アンキリンリピートタンパク質ドメインの平均サイズに相当します。3つ未満のリピート（つまり、キャッピングリピートと1つの内部リピート）を持つタンパク質は、十分に安定した三次構造を形成しません。^{[ 8 ]} DARPinの分子量は、次の図に示すように、リピートの総数に依存します。

DNAレベルで、ランダム化された潜在的な標的相互作用残基を持つDARPinのライブラリーが生成されています。これらのライブラリーから、生化学者は、ピコモル親和性で目的の標的に結合するDARPinを選択でき、共翻訳分泌を可能にするシグナル配列を使用して、リボソームディスプレイ^{[ 9 ]}またはファージディスプレイ^{[ 10 ]}を使用して特異性を選択できます。^{[ 11 ]} DARPinは、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、酵素阻害剤、または単純な標的タンパク質結合剤として機能するように設計できます。^{[ 1 ]}

DARPinsは、大腸菌の細胞質内で可溶性形態で高レベル（発酵では10 g/L以上、振とうフラスコでは1 g/L）で発現する。 ^{[ 12 ]}これらのタンパク質は、繰り返し回数の増加とともに高熱安定性（変性中間点：通常平衡アンフォールディング：ΔG > 9.5 kcal/mol ）を示す。 ^{[ 7 ] [ 13 ] [ 14 ]} DARPinsはヒト血清中で安定であり、 T細胞エピトープを含まないように設計することができる。   

高い特異性、安定性、効力、親和性、および柔軟な構造により、DARPinsは剛体結合モードを持つ。^{[ 1 ] [ 9 ]}遺伝子融合によって作られた多特異性または多価の構造は、融合DARPinsが単一ドメインDARPinsと同様の結合特性を持つことを示唆している。^{[ 1 ]}足場にシステインが存在しないため、部位特異的なシステインを設計することができ、分子への化学物質の部位指向性結合が可能になる。同じ目的で非天然アミノ酸を導入することもできる。^{[ 15 ]}

DARPinは、通常単一の疾患経路を標的とするため有効性が損なわれる可能性がある従来の治療法の限界を克服することで、臨床的利益をもたらす可能性がある。多くの場合、疾患の複雑さは複数の経路の調節異常に起因する。DARPin技術を活用することで、結合ドメインが連結された（すなわちリンカーによって連結された）数千種類の異なる「マルチDARPin」を迅速に生成でき、複数の疾患経路を標的とすることが可能になる。DARPinおよびマルチDARPinは、毒素などの非DARPin要素^{[ 16 ]}と融合させて標的治療薬を生成することもでき、DARPinの凝集に対する耐性によって製造が容易になる。マルチDARPinの多様なフォーマットと堅牢性により、特定の疾患経路で潜在的な活性を持つDARPinを効率的に特定するための経験的アプローチ（結果に基づくスクリーニングなど）が容易になる。

DARPinsの潜在的な利点は、主にその構造的および生物物理学的特性によるものです。その小さなサイズ（14～18 kDa）は組織浸透性の向上を可能にすると考えられており、その高い効力（<5～100 pM）により、DARPinsは低濃度で活性を示します。^{[ 17 ]} DARPinsは100 g/Lを超える濃度で溶解し、その高い安定性と溶解性は、医薬品化合物にとって望ましい特性と考えられています。DARPinsは、迅速かつ費用対効果の高い方法で（例えば、大腸菌から）生産できます。その薬物動態（PK）特性は、ポリエチレングリコール（PEG）などの半減期延長分子との融合、またはヒト血清アルブミンに結合するDARPinsによって調整できます。その好ましい生物物理学的特性により、^{[ 1 ]} DARPinsは標準的なプロセスを使用して開発しやすく、堅牢なクラス挙動を示す可能性があると考えられています。

DARPinは研究ツール^{[ 1 ]} 、診断薬^{[ 17 ]}、治療薬^{[ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]}として使用されてきました。臨床で最初のDARPin候補であるMP0112は、血管内皮増殖因子（VEGF）阻害剤であり、2010年初頭に湿性加齢黄斑変性（湿性AMD、新生血管性加齢黄斑変性とも呼ばれる）^{[ 16 ]}および糖尿病性黄斑浮腫^{[ 22 ]}の治療のための臨床試験に入りました。

現在、MP0112は3つの異なる臨床試験で調査されています。最初の2つの試験は、湿性AMD患者におけるアビシパーの安全性と有効性の研究であり、日本人患者と非日本人患者との比較可能性を確立するためのものです。^{[ 18 ] [ 20 ]} 3番目の試験は、DME患者におけるアビシパーの安全性と有効性をテストするためのものです。^{[ 19 ]}

2014年7月、Molecular Partnersは、がん患者を対象に、2番目のDARPin候補であるMP0250の安全性、忍容性、血中濃度を調査するヒト初回投与試験を開始した。^{[ 21 ]}

Molecular Partners AGは、眼科、腫瘍学、免疫腫瘍学、免疫学など、さまざまな疾患領域における潜在的な適応症を持つ、複数のDARPinを前臨床開発段階で保有しています。