アポトソーム

アポトーソームは、アポトーシスの過程で形成される大きな四次タンパク質構造です。その形成は、内部（内因性）または外部（外因性）の細胞死刺激に反応してミトコンドリアからシトクロム cが放出されることによって開始されます。刺激は、 DNA 損傷やウイルス感染から、オタマジャクシの尾の劣化につながるような発達のきっかけまで多岐にわたります。

哺乳類細胞では、シトクロム cが放出されると、細胞質タンパク質Apaf-1に結合してアポトーソームの形成を促進します。初期の生化学研究では、アポトーソーム形成におけるシトクロム c と Apaf-1 の比率は 2 対 1 であると示唆されています。しかし、最近の構造研究では、シトクロム c と Apaf-1 の比率は 1 対 1 であると示唆されています。また、3 番目の成分であるヌクレオチドdATP がApaf-1 に結合することも示されていますが、その正確な役割はまだ議論されています。哺乳類のアポトーソームは結晶化されたことはありませんでしたが、2002 年にヒトの APAF-1/シトクロム c アポトーソームが低温透過型電子顕微鏡によって低解像度 (2 nm )で画像化され、^[2] 7 倍対称の 7 量体の車輪のような粒子が明らかになりました。最近、クライオ電子顕微鏡法によってヒトアポトーソームの中解像度（9.5オングストローム）の構造も解明され、これによりすべてのAPAF-1ドメイン（CARD、NBARC、WD40）とシトクロムcの位置を明確に推測できるようになりました。また、単量体の不活性Apaf-1サブユニット（PDB 3SFZ）の結晶構造も明らかになりました。^{[1] [3]}

アポトーソームが形成されると、不活性なプロカスパーゼ 9をリクルートして活性化することができます。活性化されると、このイニシエーターカスパーゼはエフェクターカスパーゼを活性化し、アポトーシスにつながる一連のイベントを引き起こします。

アポトーソームという用語は、1998年に発表された辻本佳秀の論文「アポトーシスにおけるBcl-2ファミリータンパク質の役割：アポトーソームかミトコンドリアか？」で初めて紹介されました。^[4]しかし、アポトーソームは、この時点以前には三元複合体として知られていました。この複合体には、それぞれ特定のApaf-1ドメインに結合するカスパーゼ-9とBcl-XLが含まれていました。この複合体の形成は、当時、哺乳類の細胞死において制御的な役割を果たすと考えられていました。 ^[5]同年12月、The Journal of Biological Chemistryに、Apaf-1がプロカスパーゼ-9の活性化を介してアポトーシスの調節因子であることを示すさらなる論文が発表されました。^[6]

アポトーソームの基準は 1999 年に定められました。まず、アポトーソームは大きな複合体 (130 万ダルトン以上) でなければなりません。次に、その形成にはATPまたは dATPの高エネルギー結合の加水分解が必要です。最後に、機能的な形態でプロカスパーゼ 9 を活性化する必要があります。この複合体の形成は後戻りできないポイントであり、アポトーシスが発生します。安定した APAF-1 とシトクロムの多量体複合体はこの説明に当てはまり、現在ではアポトーソームと呼ばれています。^[7]

アポトーソームは2つの理由から多量体複合体であると考えられていました。第一に、複数のプロカスパーゼ9分子を切断のために近づけるためです。第二に、アポトーシスの閾値を上げるため、シトクロムcの非特異的漏出はアポトーシスをもたらさないためです。^[7]

アポトーシスがプロカスパーゼ9の活性化因子として確立されると、この経路内の変異が重要な研究分野となった。例としては、ヒト白血病細胞、卵巣癌、ウイルス感染などがある。^{[8] [9] [10]}この経路の現在の研究分野については、さらに詳しく説明する。細胞死には、APAF-1、つまりアポトーシスとは無関係な隠れた経路もある。これらの経路は、カスパーゼ3および9とも無関係である。これらの隠れたアポトーシス経路は遅いが、さらなる研究で有用であることが証明されるかもしれない。^[11]

アポトーシスは、何らかのストレスシグナルによって刺激されるミトコンドリア媒介アポトーシスの際に、アダプタータンパク質 Apaf1 (アポトーシスプロテアーゼ活性化因子 1) の周りに組み立てられる多分子ホロ酵素複合体です。アポトーシスは、何らかのストレスシグナルによって刺激される必要があります。アポトーシスの形成には、細胞質内に ATP /dATP とシトクロム c が存在する必要があります。 [ 12 ]ストレス刺激^によってシトクロムcが細胞質に放出 され、これが複数の WD-40 リピートを含む領域内の Apaf-1 のC 末端に結合します。 ^[2] Apaf-1 のオリゴマー化は、 Apaf-1 N 末端のCARD モチーフへのプロカスパーゼ 9の同期したリクルートメントを伴うようです。^[2]アポトーシスは、アポトーシスの内因性経路でカスパーゼの活性化を引き起こします。^[12]

アポトーソームの7回対称構造を持つ車輪型の7量体複合体は、電子クライオ顕微鏡技術によって27Åの解像度で初めて明らかにされ、計算された質量は約1MDaです（Acehan et al. 2002）。^[2]この車輪のような粒子には7つのスポークと中央のハブがあります。スポークの遠位領域は顕著なY字型をしています。^[12]ハブドメインは曲がったアームによってYドメインに接続されています。各Yドメインは2つのローブ（大きいものと小さいもの）で構成され、その間にシトクロムc結合部位があります。^[12]アポトーソーム構造の解像度が比較的低かったため、アポトーソームの組み立てについては2つの物議を醸すモデルが提案されました。1つのモデルでは、NODドメインが中央のハブを形成し、CARDドメインがNOD領域の上部でより自由なリングを形成することが示唆されています。^[2]別のモデルでは、Apaf-1 は拡張された形式で編成されており、N 末端 CARD とヌクレオチド結合領域の両方がアポトーソームの中央ハブを形成し、13 WD-40 リピートが 2 つのローブを構成すると提案されています。^[12]大きなローブは 7 つのリピートによって形成され、小さなローブは 6 つのリピートによって形成されます。^[12]各カスパーゼ 9 分子は中央ハブで CARD ドメインに結合し、ドーム型の構造を形成します。^[12]この論争は、最近発表されたヒトアポトーソーム-プロカスパーゼ 9 CARD 複合体の高解像度構造によって解決されました。^[1]この構造は、NOD 領域のみがアポトーソームの中央ハブを形成し (写真を参照)、CARD はアポトーソームのプラットフォームに柔軟にリンクされ、基底状態のアポトーソームでは無秩序になることを明確に示しました。^[1]アポトーソームがプロカスパーゼ-9に結合すると、Apaf-1 CARDとプロカスパーゼ-9 CARDはプラットフォームの上に位置する柔軟なディスク状の構造を形成します。^[1] WD-40の繰り返し数も13ではなく15であることが証明されており、^[1] 7枚羽根のベータプロペラと8枚羽根のベータプロペラで構成されています。^[1]

ワン氏らの証拠によると、複合体内のプロカスパーゼ-9とApaf-1の化学量論比はおよそ1:1である。^[7]これは定量的質量分析によってさらに証明された。^[13]複合体内のシトクロムcとApaf-1の化学量論は1:1であることが証明されている。^[1]オリゴマー化後にシトクロムcがアポトーソームに安定的に組み込まれる必要があるかどうかについては議論があるが、最近の構造データはシトクロムcがオリゴマー化したヒトアポトーソームを安定化させるという考えを支持している。^[1]しかし、線虫やショウジョウバエなどの非哺乳類種では、シトクロムcはアポトーソームの組み立てには必要ではない可能性がある。^[14]さらに、他のいくつかの分子、特にカスパーゼ3がアポトーソームと共精製されることが報告されており^[7]、カスパーゼ3はアポトーソーム-プロカスパーゼ9複合体に結合できることが証明されています。^[13]

Apaf-1はアポトーソームのバックボーンを形成します。N末端カスパーゼリクルートメントドメイン（CARD、残基1〜90）、中央ヌクレオチド結合およびオリゴマー化領域（NB-ARC/NOD、128〜586）、およびC末端WD40領域（613〜1248）の3つの異なる領域があり、約140KDaのタンパク質を構成しています。^[2]

• Apaf-1のCARDドメインはプロカスパーゼ9と相互作用し、アポトーソーム内のリクルートメントに関与している。^[2]
• NB-ARC/NOD領域はC.エレガンスのCed-4タンパク質と顕著な配列類似性を示す。^[2]
• Apaf1のC末端WD40領域には、2つのβプロペラ型ドメインに構造化された15個のWD-40リピートが含まれています。 ^[1] WD-40リピートは、約40アミノ酸の長さの配列で、Trp-Aspで終わり、通常はタンパク質間相互作用に関与しています。^[2]

N末端CARDドメインの後に、短いリンカーとヌクレオチド結合a/bドメイン（NBD）が続き、保存されたウォーカーボックスA（pループ155-161）とB（239-243）が含まれています。^[2]ウォーカーボックスA/Bは、dATP/ATPとMg2+の結合に重要です。^{[1] [2]} NBDの後には、小さなヘリカルドメイン（HD1）、2番目のリンカー、保存されたウィングドヘリックスドメイン（WHD）が続きます。^[2] NOD領域はNBD、HD1、WHDで構成され、ATPaseドメインを形成し、AAA+ファミリーのATPaseの一部となっています。^{[1] [2]} NODとWD-40リピート間の接合部にはスーパーヘリカルドメイン（HD2）が存在します。^[1] WD40リピートは8つと7つのグループに分かれており、リンカーで接続されています。^[1]

上記の説明はヒトのアポトソームに関するものです。他の生物のアポトソーム複合体構造は多くの類似点がありますが、図に示すように、サイズとサブユニットの数が大きく異なります。Darkと呼ばれるショウジョウバエのシステムは、8つのサブユニットのリングを持っています（PDB 4V4L）。^[14] CED-4と呼ばれる線虫のアポトソームは、8量体ですがはるかに小さく（PDB 3LQQ）、シトクロムCを結合する領域は含まれていません。^[15]

アポトーシスの開始は、プログラム細胞死（PCD）経路の最初のステップに対応します。動物では、アポトーシスは2つの方法のいずれかで触媒されます。外因性経路は細胞外リガンドが膜貫通受容体に結合するのに対し、内因性経路はミトコンドリアで起こります。^[16]この内因性経路では、ミトコンドリアからシトクロムCが放出され、その後、細胞質タンパク質Apaf-1に結合します。^{[16] [17]}したがって、シトクロムcの放出は、アポトーシスの開始に必要であり、この放出はいくつかの方法で制御されますが、最も重要なのはカルシウム イオンレベルの検出です。^[16]

シトクロム c の放出は、2 つの方法のいずれかで起こると考えられています。まず、ミトコンドリアが細胞死を誘導するシグナルを受信すると、膜透過性遷移孔(PTP) が発生し、膜間腔タンパク質が放出されます(12)。PTP は、電位依存性アニオンチャネル(VDAC)、内膜タンパク質 アデニンヌクレオチド転座分子(AdNT)、およびマトリックスタンパク質シクロフィリン D (CyD) で構成されています (12)。この孔により、ミトコンドリアが膨張し、ミトコンドリア外膜が破裂します (Diamond & McCabe、2007)。この透過性の変化に伴い、シトクロム c などのタンパク質が細胞質に放出されます (12)。この変化により、ミトコンドリア膜透過性遷移(MPT) が発生し、ミトコンドリア膜電位が崩壊して ATP の生成が停止する可能性があります(12)。この方法を薬剤シクロスポリン A (CsA) で阻害することで、2 番目の経路が発見されました (13)。シトクロム c 放出の 2 番目の方法は PTP とは無関係で、VDAC のみが関与します。プロアポトーシス タンパク質の Bcl-2 ファミリーのメンバーは、VDAC の開口を誘導できます (12)。これにより、シトクロム c を含む膜間腔タンパク質の同様の放出と、それに続く MPT が発生します (12)。

シトクロム c が存在しない場合には、Apaf-1 はモノマーの形で存在する。WD -40 ドメインはタンパク質に折り返されたままで、Apaf-1 を自己阻害状態に維持していると考えられる。^[16]さらに、いくつかの領域は非常に強く結合しているため、タンパク質は他のものと結合できない。^[16]質量分析により、自己阻害状態、つまり「ロック」状態では、ADP が Apaf-1 の ATPase ドメインに結合することがわかった。 ^[16]この状態では、このタンパク質は単一であり、カスパーゼを活性化することができない。^[要出典]

シトクロム c は Apaf-1 の WD-40 ドメインに結合します。^[16]これにより「ロック」が解除され、このドメインはもはや自己阻害されなくなります。^{[1] [16]}ただし、CARDドメインと NB-ARC ドメインは自己阻害状態のままです。^[16] CARD ドメインは、Apaf-1 が (d) ATP/ATP に結合している場合にのみこのロックから解除されます。ATP が結合すると、CARD ドメインはカスパーゼ 9 に結合できるようになります。^{[1] [16] ADP が ATPase ドメインにある場合、オリゴマー化は阻害されます。したがって、ATP の結合により、Apaf-1 は下流のカスパーゼ活性化に必要な}七角形構造にオリゴマー化されます。^{[1] [7] [16]} ATPaseドメインの変異によりタンパク質は不活性になりますが、この ADP-ATP 交換を制御する方法は不明です。^{[1] [7] [16]} オリゴマー化は、7つのシトクロムc分子、7つのApaf-1タンパク質、および十分な（d）ATP/ATPが存在する場合にのみ発生します。^[7] ATPaseドメインは、ATPaseのAAA+ファミリーに属します。このファミリーは、他のATPaseドメインと結合してヘキサマーまたはヘプタマーを形成する能力で知られています。^[16]アポトーソームは、NB-ARCドメインが中央に位置するように配向されたホイール構造に配置された7つのApaf-1分子がある場合にアクティブであると見なされます。^{[1] [16]}

この機能的なアポトーソームは、カスパーゼ9の活性化の基盤を提供することができる。^{[1] [16]カスパーゼ9は細胞質中に}酵素前駆体 として存在し、細胞内に20 nMで存在すると考えられている。^[16]酵素前駆体は活性化するために切断される必要はないことが知られているが、^[16]切断されるとプロカスパーゼ9の活性が大幅に増加する可能性がある。^[13]最初の仮説は、アポトーソームが切断前に2つのカスパーゼ9分子の二量体化のための場所を提供するというものであり、この仮説は2007年にReidlとSalvasenによって支持された。2番目の仮説は、切断はカスパーゼ9がまだ単量体形態にある間に起こるというものである。^{[13] [16]}いずれの場合も、カスパーゼ9の活性化は完全なカスパーゼカスケードの活性化とそれに続く細胞死につながる。カスパーゼカスケードを活性化する多量体タンパク質複合体の進化上の理由は、微量のシトクロムcが誤ってアポトーシスを引き起こさないようにするためであると示唆されている。^[7]

アポトーシスは自然な身体機能に必要ですが、アポトーシス経路の変異は身体に壊滅的な影響と変化を引き起こします。細胞経路の変異は細胞死を促進したり、細胞死を不可能にしたりして、身体に多大な病気を引き起こします。病気を引き起こす変異したアポトーシス経路は豊富にあり、アポトーシス活性の欠如による癌、アポトーシス活性の過剰によるアルツハイマー病、パーキンソン病やハンチントン病などの他の多くの神経変性疾患まで多岐にわたります。^[18]アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患はすべて加齢に伴う疾患であり、アポトーシスが増加し、まだ機能できる細胞や組織の機能をサポートするのに寄与する細胞が死滅します。Apaf-1-ALTは前立腺癌で見つかったApaf-1変異体で、残基339-1248がありません。アポトーソームの最近の構造研究では、Apaf-1-ALTは組み立てに必要な重要な構造成分を欠いているため、アポトーソームを形成できないことが証明されています。^[1]

細胞内の遺伝的および生化学的異常は通常、異常な細胞機能と発達を体から排除するためにプログラム細胞死を引き起こしますが、癌細胞はアポトーシスを抑制して生き残ることができる突然変異を獲得しています。電離放射線などの化学療法は、過剰刺激によってこれらの抑制されたPCD経路を活性化し、正常なPCDを促進するために開発されました。^[19]

P53 は、がんの予防に関与する腫瘍抑制因子として機能し、アポトーシス経路で自然に発生します。P53 は細胞をアポトーシスに導き、それ以上の細胞分裂を阻害するため、その細胞ががん化するのを防ぎます (16)。ほとんどのがんでは、p53 経路が変異し、機能不全の細胞を終結させる能力が失われています。p53 機能は、寿命の制限にも関与しており、p53 遺伝子の変異により優性負性型の発現が引き起こされ、長生きの動物が生まれます。たとえば、C. elegansを使用した実験では、p53 変異体の寿命の延長は、オートファジーの増加に依存することがわかりました。^[19]ショウジョウバエを使用した別の実験では、p53 変異は成体の寿命にプラスとマイナスの両方の影響を与え、性分化、PCD、老化の間に関連があると結論付けられました。^[19] p53 が寿命にどのように影響するかを判断することは、今後の研究の重要な分野です。^[要出典]

アポトーシスの阻害は癌の重要な特徴の 1 つであるため、この阻害を操作して克服し、アポトーソームを形成してカスパーゼを活性化する方法を見つけることは、新しい癌治療法の開発において重要です。^[20]アポトーソームの活性化を直接引き起こす能力は、感染した癌遺伝子を破壊できず、癌の形成が継続するため、癌治療において貴重です。外部刺激によってアポトーシスを活性化することで、アポトーシスが起こり、変異した細胞を取り除くことができます。これを実現するための多数のアプローチが現在追求されており、その中には、ヒト疾患における過剰または不十分な細胞死を修正するためのアプローチで特定のアポトーシス調節因子を標的とする、組み換え生体分子、アンチセンス戦略、遺伝子治療、および古典的な有機コンビナトリアル化学が含まれます。^[18]

一般的に、抗アポトーシスタンパク質の上方制御はアポトーシスの予防につながり、これは阻害剤によって解決できます。一方、抗アポトーシスタンパク質の下方制御はアポトーシスの誘導につながり、これはその活性に結合して修正できる活性化因子によって逆転します。アポトーシスに基づく治療法における重要な標的分子は、薬物設計のためのBcl-2です。 ^[18] Bcl-2 は、癌を阻害するアポトーシスを引き起こすことが発見された最初の癌遺伝子でした。腫瘍で過剰発現し、化学療法に抵抗性があります。 [ ^{18]科学者は、Bcl-2 抗アポトーシスタンパク質に抑制剤を結合すると、それらが阻害され、直接活性化因子が}BaxおよびBakと自由に相互作用できることを発見しました。^[18]

がん治療の標的分子として、カスパーゼファミリーとその調節因子が関与している。カスパーゼ活性の阻害は、神経変性疾患、脳卒中、心臓発作、肝臓障害などのヒト疾患における細胞死を阻止する。したがって、カスパーゼ阻害剤は、脳卒中やその他のヒト疾患の治療に有望な薬理学的ツールである。現在、前臨床段階にあるカスパーゼ阻害剤は、いくつかの神経変性疾患の逆転効果の有望な証拠を示している。最近の研究では、研究者らはM-826と呼ばれる可逆性カスパーゼ-3阻害剤を開発し、マウスモデルで脳組織の損傷を阻止する試験を行った。さらに、ハンチントン病のマウスで試験したところ、この阻害剤は横紋ニューロンの死を阻止し、このカスパーゼ阻害剤のさらなる研究に有望な効果を示した。^[18]

Apaf1/カスパーゼ-9アポトーソーム形成は、アポトーシスカスケードの重要なイベントです。活性アポトーソーム複合体の形成を防止または安定化する新しい潜在的薬剤の特定は、過剰または不十分なアポトーシスを特徴とする疾患の治療に理想的な戦略です。^[18]最近、タウリンは、ミトコンドリアの機能不全を防ぐことなく、Apaf1/カスパーゼ-9アポトーソーム形成を阻害する能力を通じて、心筋細胞における虚血誘発性アポトーシスを防ぐことが分かりました。タウリンがアポトーソーム形成を阻害する可能性のあるメカニズムは、アポトーソームの基本成分であるカスパーゼ-9の発現を低下させる能力があると特定されました。しかし、Apaf1とカスパーゼ-9はアポトーソーム以外に独立した役割を果たしており、それらのレベルを変えると細胞機能も変化する可能性があることを示す研究があります。そのため、有望な実験データにもかかわらず、いくつかの問題は未解決のままであり、臨床診療における実験薬の使用を制限しています。^[18]

アポトーシス阻害剤の発見は、アポトーシスを介した疾患の治療に新たな治療ツールを提供する。特に重要なのは、アポトーシス成分の転写レベルを変化させることなく、細胞内タンパク質間相互作用に作用してアポトーシスの安定性と活性を阻害できる新しい化合物である。^[18]アポトーシスの最近の構造研究は、アポトーシスに基づく治療法の設計に貴重なツールを提供する可能性がある。^{[1] [13]}

• タンパク質分解マップ