生細胞イメージング

生細胞イメージングは​​、タイムラプス顕微鏡を用いた生細胞の研究です。科学者は、細胞ダイナミクスの研究を通じて生物学的機能の理解を深めるためにこれを使用します。^[1]生細胞イメージングは​​、21世紀の最初の10年間に開拓されました。これまでに作成された最初のタイムラプスマイクロシネマトグラフィーの細胞のフィルムの1つは、ジュリアスリースによって作成され、ウニの卵の受精と発達を示しました。^[2]それ以来、より少ない労力で生細胞をより詳細に研究するためのいくつかの顕微鏡法が開発されました。量子ドットを使用した新しいタイプのイメージングは​​、より安定していることが示されているため使用されています。^[3]ホロトモグラフィー顕微鏡の開発では、細胞の屈折率に基づくデジタル染色を実施することで、光毒性やその他の染色に起因する欠点が無視されました。^{[4] [5]}

生物系は、無数の細胞成分が4次元にわたって相互作用し、生命と呼ばれる現象を生み出す複雑な相互作用として存在します。従来の静的イメージングツールに対応するために生物を非生物サンプルに縮小することは一般的ですが、サンプルが本来の状態から大きく外れれば外れるほど、問題の繊細なプロセスに摂動が生じる可能性が高くなります。 ^[6]したがって、生体組織の真の生理学的アイデンティティを捉えるという困難な作業には、親生物内の空間と時間の両方にわたる高解像度の視覚化が必要です。^[7]細胞内イベントの時空間画像をリアルタイムで提供するように設計された生細胞イメージングの技術的進歩は、実験中に観察された生理学的変化の生物学的関連性を裏付ける上で重要な役割を果たします。生理学的状態と密接に関係しているため、生細胞アッセイは複雑で動的な細胞イベントを調べるための標準と見なされています。^[8]細胞の移動、細胞の発達、細胞内輸送などの動的プロセスが生物学研究の焦点となるにつれ、細胞ネットワーク（in situ）および生物全体（in vivo）の3次元データをリアルタイムで取得できる技術は、生物学的システムを理解する上で不可欠なツールとなるでしょう。生細胞イメージングが一般的に受け入れられたことで、実践者の数が急速に増加し、細胞の健康を損なうことなく空間的および時間的解像度を高める必要性が確立されました。^[9]

位相差顕微鏡が導入される前は、生きた細胞を観察することは困難でした。生きた細胞は半透明なので、従来の光学顕微鏡で見えるようにするには染色する必要がありました。残念ながら、染色の過程で細胞は通常死滅してしまいます。位相差顕微鏡の発明により、染色されていない生きた細胞を詳細に観察することが可能になりました。1940年代に導入されて以来、位相差顕微鏡を使用した生細胞イメージングは​​急速に普及しました。^[11]位相差顕微鏡は、写真フィルムカメラを使用して記録された一連のタイムラプス動画（ビデオを参照）を通じて普及しました。 ^[12]発明者のフリッツ・ゼルニケは、1953年にノーベル賞を受賞しました。^[13]その後、染色されていない細胞を観察するために使用される位相差技術には、ホフマン変調顕微鏡と微分干渉顕微鏡があります。

位相差顕微鏡法では、細胞の複雑な機構を形成する特定のタンパク質やその他の有機化合物を観察することができません。そのため、合成および有機蛍光染色剤が開発され、そのような化合物を標識して蛍光顕微鏡法で観察できるようになりました（ビデオを参照）。^[15]ただし、蛍光染色剤は光毒性があり、観察すると侵襲性があり、漂白されます。そのため、長期間にわたって生きた細胞を観察する場合の使用は制限されます。そのため、非侵襲性の位相差技術は、生細胞イメージングアプリケーションで蛍光顕微鏡法の重要な補完としてよく使用されます。^{[16] [17]}ただし、ディープラーニングを活用した蛍光顕微鏡法は、光負荷と光毒性を軽減し、高解像度のライブイメージングを繰り返し行うこともできます。^[18]

デジタル画像センサーのピクセル密度が急速に増加した結果、定量的位相差顕微鏡法が生細胞イメージングの代替顕微鏡法として登場しました。^{[20] [21]}定量的位相差顕微鏡法は、非侵襲的かつ定量的であるという点で、蛍光顕微鏡法や位相差顕微鏡法よりも優れています。

従来の顕微鏡の焦点深度が狭いため、生細胞イメージングは​​、現在、単一平面上の細胞を観察することに限られています。定量的位相差顕微鏡のほとんどの実装では、1回の露出で異なる焦点面で画像を作成し、焦点を合わせることができます。これにより、将来的には蛍光技術による3次元生細胞イメージングの可能性が開かれます。^[22]回転スキャンを備えた定量的位相差顕微鏡により、生細胞の3Dタイムラプス画像を高解像度で取得できます。^{[23] [24] [4]}

ホロトモグラフィー(HT) は、生物細胞や組織などの微細サンプルの 3 次元屈折率(RI) トモグラムを測定するレーザー技術です。RI は透明または位相物体の固有の画像コントラストとして機能するため、RI トモグラムの測定により、微細位相物体のラベルフリー定量画像を提供できます。サンプルの 3D RI トモグラムを測定するために、HT はホログラフィック イメージングと逆散乱の原理を採用しています。通常、サンプルの複数の 2D ホログラフィック イメージは、干渉イメージングの原理を使用して、さまざまな照明角度で測定されます。次に、サンプル内の光散乱を逆に解くことで、これらの複数の 2D ホログラフィック イメージからサンプルの 3D RI トモグラムが再構成されます。

HT の原理は、X 線コンピューター断層撮影 (CT)、またはCT スキャンと非常によく似ています。CT スキャンは、さまざまな照射角度で人体の複数の 2D X 線画像を測定し、逆散乱理論を使用して 3D 断層画像 (X 線吸収率) を取得します。X 線 CT とレーザー HT はどちらも、単色波長の波動方程式であるヘルムホルツ方程式という同じ支配方程式を共有しています。HT は光回折断層撮影とも呼ばれます。

ホログラフィーと回転スキャンを組み合わせることで、長期にわたるラベルフリーの生細胞記録が可能になります。

非侵襲性光学ナノスコピーは、準2πホログラフィック検出方式と複雑なデコンボリューションを使用することで、このような横方向の解像度を実現できます。画像化された細胞の空間周波数は、人間の目には意味をなさないものです。しかし、これらの散乱周波数はホログラムに変換され、通常の 2 倍の解像度を持つバンドパスを合成します。ホログラムは、サンプル面上のさまざまな照明方向から記録され、サンプルのサブ波長の断層画像の変化を観察します。ナノスケールの開口部は、断層画像の再構成を較正し、コヒーレント伝達関数によって画像システムを特徴付けるのに役立ちます。これにより、現実的な逆フィルタリングが発生し、真の複雑なフィールド再構成が保証されます。^[24]

結論として、3D ホロトモグラフィー顕微鏡では、(i) 光学解像度 (実際の解像度) と (ii) サンプリング解像度 (画面上の解像度) という 2 つの用語が区別されます。

生細胞イメージングは​​、最高解像度の画像を取得することと、細胞をできるだけ長く生かし続けることとの間で慎重に妥協するものです。^[25]その結果、生細胞顕微鏡学者は、固定標本を扱うときには見落とされがちな独特の課題に直面します。 さらに、生細胞イメージングでは、特殊な光学系と検出器の仕様が使用されることがよくあります。 たとえば、理想的には、生細胞イメージングに使用される顕微鏡は、高い信号対雑音比、細胞外イベントのタイムラプスビデオをキャプチャするための高速画像取得速度、および細胞の長期生存能力を維持する必要があります。^[26]ただし、画像取得の1つの側面を最適化するだけでもリソースを消費する可能性があるため、ケースバイケースで検討する必要があります。

サンプルを扱うために対物レンズと標本の間に余分なスペースが必要な場合は、ドライレンズを使用できますが、補正環の追加調整が必要になる可能性があります。補正環は、イメージングチャンバーの違いを考慮して、対物レンズ内のレンズの位置を変更します。特殊な対物レンズは、カバーガラスの厚さを考慮しながら球面収差を補正する補正環を使用して設計されています。高開口数 (NA) ドライ対物レンズでは、補正環調整リングが可動レンズグループの位置を変更し、レンズの外側が中心に対して光を集束する方法の違いを考慮します。レンズ収差はすべてのレンズ設計に固有のものですが、解像度の維持が重要なドライレンズでは、より問題になります。^[27]

オイル浸漬法は、レンズと標本を高屈折率のオイルに浸すことで、画像の解像度を上げることができる技術である。光は屈折率の異なる媒体の間を通過するときに曲がるため、レンズとスライドの間にガラスと同じ屈折率のオイルを置くことで、屈折率間の2回の遷移を避けることができる。^[28]しかし、ほとんどの用途では、生細胞は水性環境を必要とし、オイルと水が混ざると深刻な球面収差を引き起こす可能性があるため、固定された（死んだ）標本にオイル浸漬法を使用することをお勧めします。一部の用途では、より正確な画像再構成を生成するためにシリコーンオイルを使用することができます。シリコーンオイルは、生細胞の屈折率に近い屈折率を持ち、球面収差を最小限に抑えながら高解像度の画像を生成することができるため、魅力的な媒体です。^[27]

生細胞イメージングでは、サンプルを水環境に置く必要があり、カバーガラスから 50 ～ 200 マイクロメートル離れていることが多い。そのため、水浸レンズは、環境と細胞自体の両方が水の屈折率に近いため、より高い分解能を達成するのに役立ちます。水浸レンズは、水の屈折率と互換性があるように設計されており、通常、対物レンズを調整できる補正カラーが付いています。さらに、水の屈折率が高いため、水浸レンズは開口数が高く、0 マイクロメートルより深い平面を解像する場合、油浸レンズよりも優れた画像を作成できます。^[27]

生細胞イメージングのもう 1 つのソリューションは、ディッピング レンズです。これらのレンズは、カバー スリップを必要とせず、サンプルの水性環境に直接浸すことができる水浸レンズのサブセットです。ディッピング レンズの主な利点の 1 つは、有効作動距離が長いことです。^[29]カバー スリップが不要なため、このタイプのレンズは標本の表面に近づくことができ、その結果、解像度はカバー スリップの物理的制限ではなく、球面収差による制約によって制限されます。ディッピング レンズは非常に便利ですが、レンズを「浸す」という行為によってサンプル内の細胞が乱れる可能性があるため、すべての実験に最適というわけではありません。さらに、インキュベーション チャンバーはレンズに対して開いている必要があるため、蒸発によるサンプル環境の変化を厳密に監視する必要があります。^[27]

現在、生体イメージング技術のほとんどは、高照度条件または蛍光標識のいずれかに依存しており、どちらも光毒性を引き起こし、細胞を長期間にわたって乱さずに生存させる能力を損ないます。生物学に関する知識は観察によって得られるため、イメージング技術によって引き起こされる乱れを最小限に抑えることが重要です。

共焦点顕微鏡の普及は、高出力レーザーの利用しやすさと密接に関係しており、高出力レーザーは高強度の光励起を実現できる。しかし、高出力は敏感な蛍光色素分子にダメージを与える可能性があるため、レーザーは通常、最大出力より大幅に低い出力で動作する。^{[30]光に過度にさらされると、}光退色または光毒性による光損傷が生じる可能性がある。光退色の影響により蛍光画像の品質が大幅に低下する可能性があるため、近年、より長持ちする市販の蛍光色素分子に対する需要が高まっている。その解決策の 1 つであるAlexa Fluorシリーズは、高レーザー強度でもほとんどまたはまったく退色しない。^[31]

生理学的条件下では、多くの細胞や組織タイプは低レベルの光にしかさらされません。^[32]そのため、生細胞が紫外線(UV)、赤外線(IR)、または蛍光励起波長の光にさらさないようにすることが重要です。これらの光は、それぞれDNA を損傷し、細胞温度を上昇させ、光退色を引き起こす可能性があります。^[33]蛍光体とサンプルに吸収された高エネルギー光子は、ストークスシフトに比例してより長い波長で放出されます。^[34]ただし、光子エネルギーが再放出されるのではなく、化学的および分子的変化を生み出すと、細胞小器官が損傷する可能性があります。^[35]生細胞が経験する光誘発性毒性の主な原因は、蛍光分子の励起によって生成されるフリーラジカルによるものだと考えられています。 ^[32]これらのフリーラジカルは反応性が高く、細胞成分の破壊を引き起こし、非生理学的挙動につながる可能性があります。

光損傷を最小限に抑える方法の 1 つは、サンプル内の酸素濃度を下げて活性酸素種の形成を防ぐことです。^[36]ただし、この方法は生細胞イメージングでは常に可能であるとは限らず、追加の介入が必要になる場合があります。サンプル内のフリーラジカルの影響を減らす別の方法は、退色防​​止剤を使用することです。残念ながら、市販の退色防止剤のほとんどは毒性があるため、生細胞イメージングには使用できません。^{[37]代わりに、}ビタミン Cやビタミン Eなどの天然のフリーラジカルスカベンジャーを使用すると、より短い時間スケールで生理学的行動を大幅に変更することなく使用できます。^{[38]最近、光毒性のない生細胞イメージングが開発され、商品化されました。ホロトモグラフィー顕微鏡は、低出力レーザー (レーザークラス 1: 0.2 mW/mm 2} ) のおかげで光毒性を回避します。^{[4] [5] [39]}

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