ホロトモグラフィー

ホロトモグラフィー(HT) は、生物細胞や組織などの微細サンプルの3 次元屈折率(RI)トモグラムを測定するレーザー技術です。RI は透明または位相物体の固有の画像コントラストとして機能するため、RI トモグラムの測定により、微細位相物体のラベルフリー定量画像を提供できます。サンプルの 3D RI トモグラムを測定するために、HT はホログラフィックイメージングと逆散乱の原理を採用しています。通常、サンプルの複数の 2D ホログラフィック イメージは、干渉イメージングの原理を使用して、さまざまな照明角度で測定されます。次に、サンプル内の光散乱を逆に解くことで、これらの複数の 2D ホログラフィック イメージからサンプルの 3D RI トモグラムが再構成されます。

^{最初の理論的提案はエミール・ウルフ[1]}によって発表され、最初の実験的実証はフェルヒャーら^[2]によって示されました。 2000年代から、HT技術はMIT分光研究所を含むいくつかの研究グループによって広く研究され、生物学と医学の分野に応用されてきました。HTの技術開発と応用はどちらも大幅に進歩しました。2012年に最初の商用HT企業Nanolive ^[3]が設立され、その後2014年にTomocubeが続きました。

HTの原理は、X線コンピューター断層撮影（CT）またはCTスキャンと非常によく似ています。CTスキャンは、さまざまな照明角度で人体の複数の2次元X線画像を測定し、逆散乱理論によって3次元断層像（X線吸収率）を取得します。X線CTとレーザーHTはどちらも、単色波長の波動方程式で あるヘルムホルツ方程式という同じ支配方程式を共有しています。HTは光回折トモグラフィーとしても知られています。^[4]

HT は従来の 3D 顕微鏡技術に比べて以下の利点があります。

1. ラベルフリー: 外因性のラベル剤を使用せずに細胞膜と細胞内小器官を鮮明に画像化できます。したがって、光毒性、光退色、光損傷の問題はありません。
2. 定量的イメージング機能: HT は、物質の固有の光学特性である細胞の 3D RI マップを直接測定します。測定された RI は細胞の質量密度に変換できるため、この情報を使用して細胞の質量を取得することもできます。
3. 正確で高速な測定: HT は、使用される対物レンズの開口数と画像センサーの速度に応じて、約 100 nm までの空間解像度と、数フレームから 1 秒あたり数百フレームの時間解像度を提供します。

しかし、3D RIトモグラフィーでは分子の特異性は得られません。一般に、測定されたRI情報は、細胞質と比較して明らかに高いRI値を示す 金ナノ粒子^[5]や脂肪滴^{[6]などの例外を除いて、分子やタンパク質の情報と直接関連付けることはできません。}

HTの用途としては以下が挙げられる。^[7]

HTは、蛍光タンパク質や染料などの外因性標識剤を使用せずに、生細胞や薄い組織の3D動画像を提供します。HTは定量的な生細胞イメージングを可能にし、細胞体積、表面積、タンパク質濃度などの定量的な情報も提供します。染色体のラベルフリーイメージングと定量化が発表されました。^[8]細胞内のオートファジーによるプロテアソーム分解の制御経路は、HTを使用して研究されました。^[9]

HTは相関イメージングのために他の画像診断法と併用することができます。例えば、HTと蛍光イメージングを組み合わせることで、相乗的な分析アプローチが可能になります。^{[10] [11] HTは構造情報を提供し、蛍光信号は分子特異的なイメージングを提供します。これは、}陽電子放出断層撮影（PET）やCTに光学的に類似しています。HTを使用した相関イメージングアプローチについては、さまざまなアプローチが報告されています。

細胞内脂肪滴はエネルギー貯蔵と代謝に重要な役割を果たしており、癌、肥満、糖尿病などさまざまな病態にも関連しています。HT は、遊離または細胞内脂肪滴のラベルフリーで定量的なイメージングと分析を可能にします。脂肪滴は細胞質の他の部分と比較して明らかに高い RI ( n > 1.375) を持っているため、RI トモグラムの測定により、脂肪滴の体積、濃度、乾燥質量に関する情報が得られます。^{[12]最近、HT は、泡沫細胞内の脂肪滴を測定することで、}ロベグリタゾンの標的送達に影響を与えるように設計されたナノドラッグの治療効果を評価するために使用されました。^[13]

HT はさまざまな定量的イメージング機能を提供し、個々の細胞の形態学的、生化学的、および機械的特性を提供します。 3D RI トモグラフィーは、細胞の体積、表面積、球形度(丸み) などの形態学的特性を直接提供します。 溶液の RI はその濃度に比例するため、局所 RI 値は生化学的情報または細胞質タンパク質濃度に変換できます。 ^{[14]特に、}赤血球の場合、RI 値はヘモグロビン濃度に変換できます。 HT 機器でも取得できる動的細胞膜変動の測定により、細胞の変形可能性に関する情報が得られます。 さらに、これらのさまざまな定量的パラメーターを単一細胞レベルで取得できるため、さまざまな細胞パラメーター間の相関分析が可能になります。 HT は、赤血球^[15] 、白血球^[16] 、血液貯蔵^[17]、および糖尿病の研究に利用されています。^[18]

HT の定量的ラベルフリーイメージング機能は、さまざまな感染症の研究に活用されています。特に、寄生虫に侵入した宿主細胞は、HT を使用して効果的にイメージングおよび研究できます。これは、寄生虫の染色または標識には複雑な準備プロセスが必要であり、染色/標識はいくつかの寄生虫ではあまり効果的ではないためです。マラリアを引き起こす寄生虫であるPlasmodium falciparumの個々の赤血球への侵入は、HT を使用して測定されました。^[19]宿主細胞と寄生虫の構造的および生物物理学的変化は、体系的に分析されています。バベシア寄生虫の赤血球への侵入も研究されました。^{[20]トキソプラズマ症を引き起こすアピコンプレックス門の寄生虫である} Toxoplasma gondii は、有核細胞に感染する可能性があります。T . gondiiに感染した細胞の 3D 形態と生物物理学的特性の変化は、HT を使用して研究されました。^[21]

HTを使用すると、個々の細菌や微細藻類の細胞容積と乾燥質量を効果的に定量化できます。^[22]染色プロセスを必要とせず、正確な定量値を提供するため、HTは人工染色の有効性をテストするために使用できます。

以下は、定量的位相イメージング技術の一部としての HT に関する活発な科学会議です。

• 定量的位相イメージング会議、SPIE Photonics West

HT 技術とその応用は、以下の科学雑誌の特別号に掲載されています。

• 2019年、サイトメトリーパートAにおけるラベルフリーサイトメトリーのための定量位相イメージングに関する特集号
• 物理学の最前線における定量的位相イメージングとその生物物理学、生物学、医学への応用に関する研究テーマ

• 定量的位相イメージング
• デジタルホログラフィック顕微鏡
• ホログラフィー