ランタニドプローブ

ランタニドプローブは、生物学的および化学的用途で一般的に使用される非侵襲的^[1] 分析ツールです。ランタニドは、4fエネルギーレベルが満たされた金属イオンであり、一般的には周期表のセリウムからルテチウムまでの元素を指します。^[2]ランタニド塩の蛍光は、金属イオンのエネルギー吸収が低いため弱いため、ランタニドのキレート錯体が最も一般的に使用されます。^[3]キレートという用語は、ギリシャ語の「爪」に由来し、配位結合を介して2つ以上のドナー原子を持つ金属イオンに結合する配位子の名前に適用されます。金属イオンの酸化状態が3+のときに、蛍光が最も強くなります。すべてのランタニド金属を使用できるわけではなく、最も一般的なものは、Sm(III)、Eu(III)、Tb(III)、およびDy(III)です。^[3]

1930年代初頭から、ある種のランタノイドの塩が蛍光を発することが知られていました。^{[4]ランタノイド塩と}核酸の反応は、1930年代から1940年代にかけて、核酸構造の固定にランタンを含む試薬が使用された多くの出版物で議論されました。^{[3] 1942年には、}ユーロピウム、テルビウム、サマリウムの錯体が紫外線で励起されると異常な発光特性を示すことが発見されました。^[3]しかし、生物細胞がランタノイドで染色されたのは、その20年後、大腸菌の細菌塗抹標本をユーロピウム錯体の水溶液で処理したときに、水銀灯の照明下で明るい赤色の斑点として現れたときでした。^[1] 1970年代半ば、フィンランドの研究者がEu(III)、Sm(III)、Tb(III)、Dy(III)ポリアミノカルボキシレートを時間分解発光（TRL）免疫測定法の発光センサーとして提案したことで、ランタニドプローブへの注目が大きく高まりました。^[1] 1970年代以降、ランタニドキレートと時間分解発光顕微鏡（TRLM）の分析法が最適化され、多くの科学、医療、商業分野でランタニドプローブが使用されるようになりました。^[1]

分析技術には主に 2 つあります。不均一系と均一系です。2 つのランタニドキレートを分析に次々に使用する場合、これは不均一系分析と呼ばれます。^{[4]最初の分析対象物は、}ポリマーなどの固体支持体上の特定の結合剤に結合し、次に別の反応で、最初の発光の弱いランタニド錯体を新しいより発光性の高い錯体と結合させます。^{[1] [4]}この面倒な方法が使用されるのは、2 番目のより発光性の高い化合物は、最初の分析対象物がすでに存在していなければ結合しないためです。その後、金属中心の発光プローブを時間分解検出すると、目的の信号が得られます。抗原、ステロイド、ホルモンは、不均一系技術で日常的に分析されます。均一系分析は、ランタニド標識と有機アクセプターの直接結合に依存しています。^[1]

励起分子の状態が緩和すると、蛍光と呼ばれる光の放出が起こることが多い。この放出された放射線を測定するには、周波数（波長の逆数）の関数として測定する方法と時間の関数として測定する方法の2つがある。^[4] 従来、蛍光スペクトルは異なる波長における蛍光の強度を示すが、ランタニドは蛍光減衰時間が比較的長い（1マイクロ秒から1ミリ秒の範囲）ため、時間ゼロの励起エネルギーから異なる減衰時間における蛍光放射を記録することが可能である。これを時間分解蛍光分光法と呼ぶ。^[5]

ランタノイドはサイズが小さい（イオン半径が小さい）ため、タンパク質複合体内のカルシウムやニッケルなどの金属イオンを置き換えることができるため使用できます。Ln(III)などのランタノイドイオンの光学特性は、電子[Xe]4f ⁿ構成の特殊な特徴に由来します。 ^[4]これらの構成は多くの電子レベルを生成します。その数は[14!/n!(14- n)!]で表され、Eu(III)とTb(III)の場合は3003のエネルギーレベルになります。^[1]

これらのレベルのエネルギーは、満たされた 5s および 5p サブシェルによって 4f 軌道が遮蔽されているため明確に定義されており、^[4]ランタニドイオンが挿入される化学環境に対してあまり敏感ではありません。内殻 4f-4f 遷移は、可視光と近赤外の両方の範囲にわたります。^{[1]これらは鋭く、簡単に認識できます。これらの遷移はパリティ禁制であるため、励起状態の寿命が長く、時間分解}分光法^[4]を使用できます。これは、バイオアッセイや顕微鏡検査にとって決定的な資産です。ff 遷移の唯一の欠点は、振動子の強度が弱いことですが、実際には利点に変わる可能性があります。^[1]

有機受容体（リガンド）によって吸収されたエネルギーはLn(III)励起状態に移行し、金属イオンに由来する鋭い発光バンドが、発光レベルへの急速な内部変換後に検出されます。^[1]この現象は金属中心錯体の感作（アンテナ効果とも呼ばれる）と呼ばれ、非常に複雑です。^[4] しかし、エネルギー移動経路はリガンドの長寿命三重項状態を経由します。Ln(III)イオンは三重項状態の優れた消光剤であるため、光退色が大幅に減少します。ランタニドプローブで見られる3種類の遷移は、LMCT、4f-5d、および配置内4f-4fです。最初の2つは通常、バイオアプリケーションには関係のないほど高いエネルギーで発生します。^{[1] [4]}

新しい癌治療法の開発のためのスクリーニングツールは世界中で需要が高く、酵素反応速度の測定がしばしば必要となる。^[1]ランタニド発光、特に時間分解発光の高感度は、この目的に理想的な候補であることが明らかになった。蛍光酵素基質、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) を可能にするドナー/アクセプター基を持つ基質、および免疫アッセイを使用することで、この分析を実施する方法はいくつかある。例えば、グアニンヌクレオチド結合タンパク質はいくつかのサブユニットで構成され、そのうちの 1 つはRas サブファミリーのサブユニットで構成される。^[1] Ras GTPase は、グアデノシン三リン酸 ( GTP ) をグアデノシン二リン酸 ( GDP ) に変換することでバイナリスイッチとして機能する。ノルフロキサシンとの Tb(III) 複合体の発光は、GTP から GDP への変換によって放出されるリン酸の濃度を測定するのに感度が高い。^[1]

発色団と発光金属中心からなるシステムにおける塩基部位のプロトン化は、pHセンサーへの道を切り開きます。^[4]最初に提案されたシステムのいくつかはピリジン誘導体に基づいていましたが、これらは水中で安定していませんでした。^[1]コアが通常ホスフィネート、カルボキシレート、または4つのアミド配位基を持つ置換マクロサイクルである、より堅牢なセンサーが提案されています。溶液のpHを6から2に下げると、ランタニド発光プローブの発光が約6倍に増加することが観察されています。^[1]

過酸化水素はランタニドプローブの発光によって高感度に検出できますが、比較的高い pH 値でのみ検出できます。2002 年に、さまざまなテトラサイクリンとのユーロピウム錯体が過酸化水素と結合して発光錯体を形成するという発見に基づいて、ランタニドベースの分析手順が提案されました。 ^[1]

ランタニドプローブのFRETは、約15～100オングストローム離れた2点間の距離を測定するために広く使用されている技術です。^[6]測定は、遺伝子組み換え染料を使用してin vitroで生理学的条件下で行うことができ、多くの場合、in vivoでも行うことができます。この技術は、ドナー蛍光体からアクセプター染料への距離依存のエネルギー移動に依存しています。ランタニドプローブは、CAPタンパク質によって曲げられたDNA複合体の距離を測定するために、DNA-タンパク質相互作用（テルビウムキレート錯体を使用）の研究に使用されています。^[6]

ランタニドプローブは、タンパク質の構造変化を検出するために使用されています。最近、神経インパルスに関与する電位依存性チャネルであるシェーカーカリウムイオンチャネル[6]がこの技術を使用して測定されました。[ 7 ^]一部の科学者は、FRETに非常によく似たランタニドベースの発光共鳴エネルギー移動（LRET）を使用して、原核生物でのDNAへの結合と転写開始時のRNAポリメラーゼの構造変化を研究しました。LRETは、筋細胞内のタンパク質ジストロフィンとアクチンの相互作用の研究にも使用されました。ジストロフィンは内筋細胞膜に存在し、アクチンフィラメントに結合することで筋繊維を安定化させると考えられています。Tb標識モノクローナル抗体で標識された特異的に標識されたジストロフィンが使用されました。^[6]

従来のウイルス診断法は、ランタニドを用いた高感度免疫測定法に置き換えられつつある。時間分解蛍光法は一般的に適用可能であり、臨床検体中のウイルス抗原の検査でもその性能がテストされている。^[6]

MRI機能とランタニドプローブを組み合わせたデュアルアッセイのシステムがいくつか提案されています。 ^[4]発光プローブは、たとえばMRI造影剤の位置を特定するために使用できます。^[8]これは、培養細胞への核酸の送達を視覚化するのに役立ちました。ランタニドは蛍光ではなく、磁気特性のために使用されます。^{[8] [9]}

ランタニドプローブは、蛍光寿命が長く、ストークスシフトが大きく、発光ピークが狭いなど、ユニークな蛍光特性を示します。これらの特性は、受容体-リガンド相互作用の分析プローブの開発に非常に有利です。CXC ​​R1、^[10]、インスリン様ファミリーペプチド受容体2、^[11]、プロテアーゼ活性化受容体2、^[12] 、 β2アドレナリン受容体^[13]、C3a受容体^[14]などのGPCRに対して、ランタニドベースの蛍光研究が数多く開発されています。

励起されたランタニドから放出された光子は、単一光子検出などの高感度デバイスと技術によって検出されます。励起された放出レベルの寿命が十分に長い場合は、時間分解検出（TRD）を使用して信号対雑音比を高めることができます。^[5] LRETを実行するために使用される機器は比較的単純ですが、従来の蛍光計よりも少し複雑です。一般的な要件は、パルスUV励起源と時間分解検出です。

短時間パルスを発する光源は、以下のカテゴリーに分類できます。^[3]

• フラッシュチューブ
• 機械的または電子的に切断された放電ランプ
• スパークギャップ
• パルスレーザー

パルス光源の選択において最も重要な要素は、光の持続時間と強度です。^[3] 300～500 nm の範囲のパルスレーザーは、現在、蛍光分光法におけるスパークキャップに取って代わりました。使用されるパルスレーザーには、パルス励起レーザー、G スイッチングレーザー、モードロックレーザー、キャビティダンプレーザーの 4 つの一般的なタイプがあります。パルス窒素レーザー(337 nm) は、時間分解蛍光測定における励起源としてよく使用されています。^[3]

時間分解蛍光測定では、高速光電子増倍管が唯一の実用的な単一光子検出器です。優れた単一光子分解能は、ランタニドキレートなどの長時間減衰蛍光プローブからの光子を計数する際にも有利です。^[4]

現在市販されている機器としては、パーキンエルマー社製マイクロフィルター蛍光計LS-2、パーキンエルマー社製ルミネセンス分光計モデルLS5、LKB-ワラック社製時間分解蛍光計モデル1230などがあります^。[3]

ランタニドプローブのリガンドは、プローブが適切に機能するためにいくつかの化学的要件を満たす必要があります。これらの要件とは、水溶性、生理学的pHでの大きな熱力学的安定性、運動学的不活性、および生体物質の破壊を最小限に抑えるための330 nmを超える吸収です。^[1]

これまでに研究され利用されてきたキレート化合物は、以下のグループに分類できます。^[3]

1. トリスキレート（3つの配位子）
2. テトラキスキレート（4つの配位子）
3. 混合配位子錯体
4. 中性ドナーとの複合体
5. その他、フタル酸エステル、ピクリン酸エステル、サリチル酸エステルの複合体など。

リガンドからイオンへのエネルギー移動の効率は、リガンド-金属結合によって決まる。エネルギー移動は、イオン結合よりも共有結合の方が効率的である。^[15]リガンド中のヒドロキシ、メトキシ、メチル基などの電子供与性の置換基は、蛍光を増加させる。^[3]電子吸引性基（ニトロなど）が結合すると、逆の効果が見られる。^{[3] [4]さらに、蛍光強度は、リガンドへのフッ素置換によって増加する。フッ素化基の電気}陰性度 によってユーロピウム-酸素結合がより共有結合的になるため、金属イオンへのエネルギー移動が増加する。フェニルをナフチル基に置き換えることによる芳香族置換基による共役の増加は、蛍光を増強することが示されている。^[15]

• 分光法
• 蛍光測定
• 酵素
• バイオセンサー
• MRI造影剤