Loading article…
蛍光分光法（蛍光測定法または分光蛍光測定法とも呼ばれる）は、試料からの蛍光を分析する電磁分光法の一種です。この方法では、通常は紫外線である光線を用いて、特定の化合物の分子内の電子を励起し、光を放出させます。放出される光は、一般的には可視光ですが、必ずしも可視光であるとは限りません。補完的な手法として、吸収分光法があります。単一分子蛍光分光法という特殊な場合、放出された光の強度変動は、単一の蛍光体、または蛍光体のペアから測定されます。
蛍光を測定する装置は蛍光光度計と呼ばれます。
分子には、エネルギー準位と呼ばれるさまざまな状態があります。蛍光分光法は主に電子状態と振動状態に関係しています。一般的に、調べられる分子種は、関心のある基底電子状態（低エネルギー状態）と、より高いエネルギーの励起電子状態を持っています。これらの各電子状態内には、さまざまな振動状態があります。[ 1 ]
蛍光では、まず光子を吸収することで、分子は基底電子状態から励起電子状態の様々な振動状態のいずれかに励起されます。他の分子との衝突により、励起された分子は振動エネルギーを失い、励起電子状態の最低振動状態に達します。この過程は、ヤブロンスキー図で視覚化されることがよくあります。[ 1 ]
分子はその後、基底電子状態のさまざまな振動準位のいずれかに再び遷移し、その過程で光子を放出します。[ 1 ]分子は基底状態のいくつかの振動準位のいずれかに遷移する可能性があるため、放出される光子は異なるエネルギー、したがって異なる周波数を持ちます。したがって、蛍光分光法で放出される光のさまざまな周波数とそれらの相対強度を分析することにより、さまざまな振動準位の構造を決定できます。
原子種の場合も同様のプロセスですが、原子種は振動エネルギー準位を持たないため、放出される光子は入射光と同じ波長になることがよくあります。吸収された光子を再放出するこのプロセスは「共鳴蛍光」と呼ばれ、原子蛍光の特徴ではありますが、分子蛍光でも見られます。[ 2 ]
典型的な蛍光（発光）測定では、励起波長（蛍光体を励起するために使用される入射光の波長）は固定され、検出波長が変化する（発光スペクトルが生成される）のに対し、蛍光励起測定では、検出波長は固定され、励起波長が関心領域全体で変化するため、励起スペクトルが生成される。励起-発光マトリックスは、さまざまな励起波長から得られる発光スペクトルを記録し、それらをすべて組み合わせることによって得られる。[ 3 ] [ 4 ]これは、励起波長と発光波長の関数としての発光強度を表す3次元表面データセットであり、通常は等高線マップとして表示される。
大きく分けて2種類の装置が存在する。入射光と蛍光光を分離するためにフィルターを使用するフィルター蛍光光度計と、入射光と蛍光光を分離するために回折格子モノクロメーターを使用する 分光蛍光光度計である。
どちらの方式も、励起光源からの光がフィルターまたは分光器を通過して試料に照射されるという仕組みを採用しています。入射光の一部は試料に吸収され、試料中の分子の一部が蛍光を発します。蛍光はあらゆる方向に放出されます。この蛍光の一部は、さらに別のフィルターまたは分光器を通過して検出器に到達します。検出器は通常、透過光や反射光が検出器に到達するリスクを最小限に抑えるため、入射光ビームに対して90°の角度に配置されます。
励起光源としては、レーザー、LED、ランプなど様々な光源が使用可能であり、特にキセノンアークランプや水銀蒸気ランプが挙げ られます。レーザーは、通常0.01 nm以下の非常に狭い波長範囲でのみ高放射照度を発するため、励起モノクロメーターやフィルターは不要です。この方法の欠点は、レーザーの波長を大きく変更できないことです。水銀蒸気ランプはラインランプであり、ピーク波長付近で光を発します。一方、キセノンアークランプは、300～800 nmの範囲でほぼ一定の強度を持つ連続発光スペクトルを持ち、200 nmを わずかに超える波長まで測定するのに十分な放射照度を有しています。
蛍光光度計では、フィルターやモノクロメーターが使用されることがあります。モノクロメーターは、波長を調整可能な許容誤差で透過させます。最も一般的なタイプのモノクロメーターは回折格子を利用しており、平行光が回折格子を照射し、波長に応じて異なる角度で出射します。モノクロメーターを調整することで、透過させる波長を選択できます。異方性測定を行うには、2つの偏光フィルターを追加する必要があります。1つは励起モノクロメーターまたはフィルターの後、もう1つは発光モノクロメーターまたはフィルターの前に配置します。
前述のように、蛍光は励起光に対して90°の角度で測定されることがほとんどです。この配置は、透過励起光の干渉を避けるために、センサーを励起光の線上に180°の角度で配置する代わりに用いられます。モノクロメーターは完璧ではなく、迷光、つまり目的の波長以外の波長の光を透過します。理想的なモノクロメーターは、指定された範囲の光のみを透過し、波長に依存しない高い透過率を持ちます。90°の角度で測定する場合、サンプルによって散乱された光のみが迷光の原因となります。これにより、信号対雑音比が向上し、180°の配置と比較して検出限界が約10000分の1に低下します[ 5 ]。さらに、蛍光は正面から測定することもでき、これは濁ったサンプルや不透明なサンプルに対してよく行われます[ 6 ] 。
検出器は、シングルチャンネル型とマルチチャンネル型のいずれかを選択できる。シングルチャンネル型検出器は一度に1つの波長の強度しか検出できないが、マルチチャンネル型検出器はすべての波長の強度を同時に検出できるため、発光モノクロメーターやフィルターは不要となる。
デュアルモノクロメーターと連続励起光源を備えた最も汎用性の高い蛍光光度計は、励起スペクトルと蛍光スペクトルの両方を記録できます。蛍光スペクトルを測定する場合、励起光の波長は一定に保たれ、好ましくは吸収率の高い波長に設定され、発光モノクロメーターがスペクトルをスキャンします。励起スペクトルを測定する場合、発光フィルターまたはモノクロメーターを通過する波長は一定に保たれ、励起モノクロメーターがスキャンされます。蛍光強度は吸収に比例するため、励起スペクトルは一般的に吸収スペクトルと同一です。[ 7 ]
UV/可視分光法とは異なり、「標準」の、装置に依存しないスペクトルは容易には得られません。いくつかの要因がスペクトルに影響を与え、歪ませるため、「真の」、つまり装置に依存しないスペクトルを得るには補正が必要です。ここでは、さまざまな種類の歪みを、装置関連またはサンプル関連に分類します。まず、装置に起因する歪みについて説明します。まず、光源の強度と波長特性は、各実験中および各実験間で時間とともに変化します。さらに、すべての波長で一定の強度を持つランプはありません。これを補正するために、励起モノクロメーターまたはフィルターの後にビームスプリッターを適用して、光の一部を基準検出器に導くことができます。
さらに、分光器やフィルターの透過効率も考慮する必要があります。これらは時間とともに変化する可能性があります。分光器の透過効率は波長によっても変化します。そのため、励起分光器またはフィルターの後ろにオプションの参照検出器を配置する必要があります。検出器が検出する蛍光の割合もシステムによって異なります。さらに、検出器の量子効率、つまり検出される光子の割合は、検出器の種類、波長、そして検出器の劣化に伴い時間とともに変化します。
考慮すべきもう2つのトピックは、放射線を照射するために使用される光学系と、試料を保持または収容する手段（キュベットまたはセルと呼ばれる）です。ほとんどの紫外線、可視光、近赤外線測定では、精密な石英キュベットの使用が必要です。どちらの場合も、対象となる波長範囲で吸収が比較的少ない材料を選択することが重要です。石英は200 nm～2500 nmの波長を透過するため理想的です。より高グレードの石英は3500 nmまで透過できます が、他の材料の吸収特性は試料からの蛍光を覆い隠してしまう可能性があります。
これらすべての測定機器の要因を補正して「標準」スペクトルを得る作業は煩雑であり、実際に必要な場合にのみ適用されます。例えば、量子収率を測定する場合や、発光強度が最も高い波長を見つける場合などがこれに該当します。
前述のように、歪みはサンプルからも生じます。したがって、サンプルのいくつかの側面も考慮する必要があります。まず、光分解により、時間の経過とともに蛍光強度が低下する可能性があります。光の散乱も考慮する必要があります。この文脈で最も重要な散乱の種類は、レイリー散乱とラマン散乱です。レイリー散乱によって散乱された光は入射光と同じ波長を持ちますが、ラマン散乱では散乱光の波長は通常より長い波長に変化します。ラマン散乱は、励起光によって誘起された仮想電子状態の結果です。この仮想状態から、分子は振動基底状態以外の振動レベルに緩和する可能性があります。[ 9 ]蛍光スペクトルでは、常に励起波数に対して一定の波数差で見られます。たとえば、ピークは水中の励起光よりも3600 cm −1低い波数で現れます。
考慮すべきその他の側面としては、内部フィルター効果があります。[ 10 ] [ 11 ]これには再吸収が含まれます。再吸収は、蛍光体が放射を放出する波長で別の分子または高分子の一部が吸収されるために起こります。この場合、蛍光体から放出された光子の一部または全部が再び吸収される可能性があります。もう1つの内部フィルター効果は、蛍光体を含む吸収分子の高濃度によって発生します。その結果、励起光の強度は溶液全体で一定ではありません。結果として、検出システムで見える蛍光体に到達する励起光の割合はごくわずかです。内部フィルター効果は放出光のスペクトルと強度を変化させるため、蛍光の発光スペクトルを分析する際には考慮する必要があります。[ 7 ] [ 12 ]
折り畳まれたタンパク質の蛍光は、個々の芳香族残基からの蛍光の混合物です。折り畳まれたタンパク質の固有蛍光発光の大部分はトリプトファン残基の励起によるもので、チロシンとフェニルアラニンによる発光も一部ありますが、ジスルフィド結合もこの波長範囲でかなりの吸収を示します。通常、トリプトファンの最大吸収波長は280 nmで、発光ピークは溶媒和発色性があり、局所環境の極性に応じて約300～350 nmの範囲になります[ 13 ]。 したがって、タンパク質の蛍光は、タンパク質の立体構造状態の診断に使用できます[ 14 ] 。 さらに、トリプトファンの蛍光は、他の残基の近接性によって強く影響を受けます（つまり、AspやGluなどの近くのプロトン化された基は、Trp蛍光の消光を引き起こす可能性があります）。また、トリプトファンと他の蛍光アミノ酸との間でエネルギー移動が起こる可能性があり、特にフォースター酸性法を用いる場合には、分析結果に影響を与える可能性があります。さらに、トリプトファンは比較的まれなアミノ酸であり、多くのタンパク質にはトリプトファン残基が1つまたは少数しか含まれていません。そのため、トリプトファン蛍光は、個々のトリプトファン残基の立体構造状態を非常に高感度に測定することができます。外因性プローブと比較した場合の利点は、タンパク質自体が変化しないことです。タンパク質立体構造の研究に内在性蛍光を用いるのは、実際にはトリプトファン残基が少ない（あるいは1つしかない）場合に限られます。これは、それぞれのトリプトファン残基が異なる局所環境にさらされ、異なる発光スペクトルが生じるためです。
トリプトファンは重要な内在性蛍光（アミノ酸）であり、トリプトファンの微小環境の性質を推定するために使用できます。変性剤、界面活性剤、またはその他の両親媒性分子を使用して実験を行うと、トリプトファンの微小環境が変化する可能性があります。たとえば、「疎水性」コアに単一のトリプトファンを含むタンパク質が温度上昇とともに変性すると、赤方偏移した発光スペクトルが現れます。これは、トリプトファンが疎水性のタンパク質内部ではなく水性環境に露出するためです。対照的に、水性溶媒に露出しているトリプトファンを含むタンパク質に界面活性剤を加えると、トリプトファンが界面活性剤の小胞またはミセルに埋め込まれている場合、青方偏移した発光スペクトルが発生します。[ 15 ]トリプトファンを欠くタンパク質は、蛍光色素と結合することができます。
295 nmの蛍光励起では、トリプトファンの発光スペクトルが、より弱いチロシンおよびフェニルアラニンの蛍光よりも優勢である。
時間分解蛍光タンパク質（TRFP）は、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）などの天然蛍光タンパク質から派生した生体分子であり、TRFPはpHや分子間相互作用などの環境要因によって変化する限られた時間（1～10ナノ秒）蛍光を発します。2000年代初頭に始まったTRFPは、蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）を強化し、自家蛍光を最小限に抑え、シグナル多重化を可能にすることで、強度ベースの方法よりも優れたコントラストを提供します。[ 16 ]
TRFPは励起後に発光し、その寿命は時間相関単一光子計数法によって測定される。mTFP1（青緑色、約2.6 ns）やmScarlet-I（赤色、約3.1 ns）などの変異体は、高い量子収率と光安定性を誇り、生細胞イメージングに適している。遺伝子コード化されたTRFPは、プラスミドを介して細胞に組み込まれ、タンパク質の折り畳み、イオンシグナル伝達、または酵素活性の非侵襲的なイベント追跡を可能にする。[ 16 ]
AI最適化TRFPは、寿命が長く、発光が明るいため、超解像顕微鏡法が進歩します。TRFPは、ショウジョウバエやゼブラフィッシュなどのモデル生物で使用されています。課題としては、光退色リスク、複雑なFLIM装置、散乱による深部組織への浸透の制限などがあります。赤方偏移変異体は、この問題を解決できる可能性があります。[ 16 ]
他の研究では、標的遺伝子研究のためにTRFPとCRISPRを組み合わせる試みが行われている。 [ 16 ]
腫瘍微小環境の検出など、臨床診断への統合には、費用対効果の高いFLIMが必要です。現在進行中の研究では、輝度の向上、毒性の低減、スペクトル範囲の拡大を目指しています。[ 16 ]
2025年、研究者たちは28種類の新しいTRFPを作成し、色や時間間隔を追加することで、この技術を使用するための選択肢を大幅に増やしました。彼らは、蛍光シグナルを生成する領域を不安定化するために、いくつかのアミノ酸残基に変異を加えました。[ 17 ]
蛍光分光法は、有機化合物の分析など、生化学、医学、化学研究分野において広く用いられている。また、悪性皮膚腫瘍と良性皮膚腫瘍の鑑別にも利用されているという報告もある。
原子蛍光分光法（AFS）技術は、空気や水、その他の媒体中に存在する化合物の分析／測定にも有用であり、例えば、水銀などの重金属の検出に使用されるCVAFSなどが挙げられる。
蛍光は光子の方向を変えるためにも利用できる（蛍光式太陽光集熱器を参照） 。
さらに、蛍光分光法はマイクロ蛍光測定法を用いて微視的なレベルにも応用できる。
分析化学では、蛍光検出器はHPLCと組み合わせて使用される。
水研究の分野では、蛍光分光法は有機汚染物質を検出することで水質を監視するために使用できます。[ 18 ]コンピュータ科学と機械学習の最近の進歩により、水の細菌汚染の検出も可能になりました。[ 19 ]
生物医学研究では、蛍光分光法は、蛍光剤を様々な薬剤に架橋させることにより、薬剤分布の効率を評価するために用いられる。[ 20 ]
生物物理学研究における蛍光分光法は、細胞膜内の脂質ドメインを可視化し、特徴づけることを可能にする。[ 21 ]
TFRPは、分子間の近接性を研究したり、癌や神経変性疾患などの疾患における代謝変化をモニタリングしたりするために、 Förster共鳴エネルギー移動（FRET）に使用されます。