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キスアンドラン融合は、シナプス小胞が一時的に開閉するタイプのシナプス小胞放出です。このエキソサイトーシスでは、小胞がシナプス前膜にドッキングして一時的に融合し、融合孔を通してシナプス全体に神経伝達物質を放出します。小胞は、初期構造が適切に維持されるため、融合後にすぐに再利用でき、運動学的に効率的なエネルギー利用が可能になります。[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]
キスアンドランは、分泌小胞が融合孔の完全な拡張を通して内容物を素早く放出する完全融合とは異なります。[ 5 ]これらの化学伝達物質が細胞外空間に放出された後、[ 6 ]小胞は完全に形質膜に崩壊し、その後クラスリンコート依存プロセスによって回収されます。[ 7 ]
神経伝達物質がシナプス小胞とシナプス前膜の融合によって「量子」で放出される可能性があるという考えは、神経終末の最初の電子顕微鏡画像が初めて登場した1955年に、ベルナール・カッツとホセ・デル・カスティージョによって初めて提唱されました。 [ 8 ]小胞膜の一時的な融合と迅速な回収の可能性は、1973年にブルーノ・チェッカレッリによって、強く刺激されたカエルの神経筋接合部を電子顕微鏡で調べた後に提案され、その後数年間、彼のグループが電気生理学、電子顕微鏡、および急速凍結技術を使用して行った研究によって間接的に支持されました。[ 9 ]実際の用語である「キス・アンド・ラン」は、膜容量と電流測定による伝達物質放出の同時測定の最初の研究が行われ、分泌産物が一時的な小胞融合中に実際に放出される可能性があることを示した後に、チェッカレッリの共同研究者によって導入されました。[ 3 ]
今日では、完全融合とキスアンドラン融合のどちらがシナプス放出のメカニズムをより正確に表しているかについて、議論が交わされている。[ 11 ]電子顕微鏡写真で観察される、分泌後に部分的に空になった分泌小胞の蓄積の増加は、キスアンドランモデルを支持する最も説得力のある証拠である。この蓄積は、分泌過程中に小胞内容物の一部だけが細胞から出ることを示唆しており、これは分泌小胞が一時的に細胞形質膜と連続性を確立し、内容物の一部を排出し、その後分離して再封印される場合にのみ可能となる。
一過性の小胞融合は、1955 年に Katz と del Castillo によって仮説として提唱されました。[ 12 ]しかし、最初の体系的な研究は、1973 年に Ceccarelli らによって強直刺激を用いて行われました。[ 13 ] Ceccarelli らは、カエルの神経筋接合部を研究し、エンドサイトーシスされた細胞小器官を識別するために西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などのマーカーで刺激し、 20 分から 4 時間の範囲で、弱い刺激 (2 Hz) または強い刺激 (10 Hz) のプロトコルを使用しました。 [ 2 ] [ 13 ] 4 時間にわたる弱い刺激では、Ceccarelli らは、時間の経過とともに HRP 標識小胞が増加し、大きな細胞小器官の増加が見られないことを発見しました。これは、小胞がシナプス前膜と急速に融合し、神経伝達物質を放出した後に分離することを示しています。[ 2 ]彼らは、刺激の周波数が低い場合、刺激中および刺激後に小胞の大部分がシナプス前膜から速やかに再形成されると仮説を立てた。[ 2 ] Ceccarelli の研究室でのさらなる研究により、電気生理学的データと形態学的データを比較することで、一過性融合の仮説に関する証拠が蓄積された。特に、凍結割断されたシナプス前膜と、神経に単一のショックを与えてから数ミリ秒後に急速凍結された終末から得られた電子顕微鏡画像で、小胞融合の画像が調べられた。[ 14 ] 1993 年、Alvarez de Toledo らは、膜容量の測定 (表面積の変化を監視する) とメディエーターの放出の電流測定検出を組み合わせることにより、一過性に融合する小胞の瞬間的な開口中に分泌産物の放出が起こることを直接実証した。[ 10 ]これにより Fesce らは、[ 3 ]一時的な融合を支持するすべての間接的な証拠を要約し、「キス・アンド・ラン」という用語を作り出した。一時的な融合、またはキス・アンド・ラン融合の最も説得力のある証拠は、ポロソームの発見から得られたものである。[ 15 ]ポロソームは、細胞形質膜にある永久的なカップ状のリポタンパク質構造であり、分泌小胞が一時的にドッキングして融合し、小胞内の内容物を細胞から放出する。
Ceccarelliらによるキスアンドラン機構の発見以来、キスアンドラン融合を支持する証拠を提供する多くの研究が行われてきました。すべての研究は、キスアンドラン融合が完全融合に比べて2つの主な利点を持っていることを示唆しています。1) キスアンドランでは分泌小胞の形状が安定しているため、小胞のリサイクルがより効率的になります。2) キスアンドランでは融合孔が小さく、神経伝達物質が実際に放出される時間が短いため、放出される神経伝達物質の量を制限できます[ 1 ]。
キスアンドラン証拠の主要な問題点の1つ、そしてキスアンドランに対する多くの反論の根拠となっているのは、融合が非常に短いため、実際のキスアンドランイベントを捉えることが非常に難しいという点である。[ 16 ]しかし、分泌後に部分的に空になった小胞が蓄積することは、キスアンドラン機構を強く支持しており、分泌過程中に小胞内容物の一部のみが細胞から出ることを示唆している。これは、分泌小胞が一時的に細胞形質膜と連続性を確立し、内容物の一部を排出し、その後分離して再封印する場合にのみ可能となる。ポロソームは細胞形質膜上の恒久的な構造であり、分泌小胞サイズのほんの一部しか測定できないため、分泌小胞は完全に崩壊するのではなく、「一時的に」ドッキングして連続性を確立することを示している。
ラットの膵臓β細胞は、キスアンドラン融合によって神経伝達物質を放出する。内分泌細胞および神経内分泌細胞では、シナプス様小胞（SLV）がキスアンドランを起こすが、大型濃染顆粒小胞（LDCV）もキスアンドランを起こすかどうかは議論の的となっている。[ 17 ]研究では、LDCVがキスアンドランエキソサイトーシスを起こすことが示されている。[ 17 ] [ 18 ] MacDonaldらは、ラットβ細胞におけるキスアンドランエキソサイトーシスをテストするために複数のアプローチを使用した。10 mMグルコースと5 mMフォルスコリンの存在下で無傷のラットβ細胞の膜パッチをモニタリングすることにより、MacDonaldらは、エキソサイトーシスイベントに続いて同様の規模のエンドサイトーシスイベントが見られることから、一部の小胞がキスアンドランを起こしていることを発見した。[ 17 ] LDCVのエキソサイトーシスの25%とSLVのエキソサイトーシスの28%はキスアンドラン現象であった。[ 17 ]フォルスコリン存在下ではLDCVのキスアンドランが25%の確率で発生したが、フォルスコリン非存在下ではLDCVのキスアンドラン融合はわずか7%の確率でしか発生しなかった。[ 17 ]フォルスコリンはサイクリックAMP （cAMP）レベルを上昇させるため、cAMPはラット膵臓β細胞におけるLDCVのキスアンドラン融合のメカニズムにおいて非常に重要な役割を果たしていると考えられる。
キスアンドラン中のSLV（孔径：0.8±0.1 nm）およびLDCV（孔径：1.4±0.1 nm）融合孔は、 γ-アミノ酪酸（GABA）およびアデノシン三リン酸（ATP）の流出を可能にするのに十分な大きさであるが、ラット膵臓β細胞でインスリンを放出するには小さすぎることが示されている。[ 17 ]したがって、キスアンドラン機構は、インスリンに関連する医学的合併症に関与している可能性がある。
キスアンドラン放出は、海馬に位置するニューロンのシナプスで起こることが示されている。マーカーとして小胞または膜に挿入された両親媒性色素FM1-43を用いた研究は、海馬シナプスにおけるキスアンドランを裏付ける上で重要な役割を果たしてきた。海馬シナプスでは、小胞は脳内の興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の正常な放出を可能にする一方で、FM1-43色素が小胞に出入りすることを許さないことが示されており、キスアンドランを示唆する一過性のメカニズムを示している。[ 19 ]また、浸透圧の上昇は、海馬シナプスにおける色素放出を減少させることも示されている。様々な高張液中では、0.5 osMで刺激された小胞から放出されたFM1-43色素は、1.5 osMで刺激された小胞から放出された色素よりも70%多かった。[ 19 ]したがって、体内の高張領域にある小胞は、キスアンドラン型のエキソサイトーシスを起こしやすい可能性がある。
ミトコンドリアは、内膜物質の交換においてキスアンドラン融合を示す。ラット細胞においてミトコンドリアマトリックスを標的とした緑色光活性化赤色蛍光KFPとシアン光活性化緑色蛍光PAGFPを用いた研究では、KFPとPAGFPが一時的な融合によって一方のミトコンドリアからもう一方のミトコンドリアへ転移する相互作用が示され、キスアンドラン機構が示唆された。[ 20 ]単一のオルガネラとなるミトコンドリアの完全な融合とは異なり、2つのミトコンドリアの一時的なキスアンドラン融合は、2つの異なる膜をもたらした。[ 20 ]
視神経萎縮1 （Opa1）遺伝子の操作は、ミトコンドリア間の融合に興味深い影響を及ぼした。Opa1遺伝子のサイレンシングは、24時間後にミトコンドリアの完全な融合活性を低下させ、Opa1遺伝子のサイレンシングが48時間後には完全な融合活性が完全に消失した。[ 20 ]一過性のキスアンドラン融合活性は、Opa1サイレンシング後24時間経過しても変化しなかった。[ 20 ]キスアンドラン融合は、Opa1遺伝子発現レベルが低い場合と、Opa1遺伝子発現レベルが非常に高い場合に最も一般的である。結果として、Opa1発現は、キスアンドランに関してミトコンドリアの融合を制御する。
ミトコンドリアのキスアンドラン融合は、完全融合に比べて、ミトコンドリアの運動性が低下した状態をより短い時間維持するのに役立ちます。Liu らは、キスアンドラン融合と完全融合の両方と、それらがミトコンドリアの運動性に及ぼす影響をテストし、両方の融合形態が最初はミトコンドリアの運動性を低下させるものの、キスアンドラン融合は、キスアンドランイベントが終了した直後にミトコンドリアの運動性を回復させ、さらに増加させることを発見しました。[ 20 ]キスアンドラン融合は、完全融合よりもミトコンドリアの生体エネルギーを制御するための優れたメカニズムを提供します。
初期の融合を比較すると、キスアンドラン融合モデルは、ミトコンドリアが横から間接的に接近し、しばしば異なる微小管複合体に連結しながら、活発なミトコンドリア運動中に継続します。[ 20 ]しかし、完全な融合には、単一の微小管を頭尾方向に移動する必要があります。[ 20 ]
キスアンドラン融合は、小胞のアクチンコーティングによって安定化されると考えられてきた。小胞が膜と融合したタイミングをFM1-43の小胞取り込みで調べたところ、研究者らは、アクチンコーティングがキスアンドラン機構に必要なステップであることに気づいた。β-アクチン-緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識された小胞は、シナプス前膜と融合してから数秒後に蛍光を発したが（FM1-43の取り込みで示されるように）、融合していない小胞は蛍光を発しなかった。これは、キスアンドランにはアクチンコーティングが必要であることを示唆している。[ 21 ]このアクチンコーティングは、アクチンモノマーの重合によって生じた。
一過性のキスアンドラン融合に必要なアクチンコーティングプロセスはカルシウムによって媒介される。小胞のアクチンコーティングはカルシウムを除去するBAPTA-AMによって阻害された。BAPTA-AMの使用によりカルシウムがなくなると、融合した小胞はすべてシナプス前膜に付着したままだったが、神経伝達物質を放出しなかった。これは、アクチンコーティングを作るにはカルシウムが必要であり、アクチンコーティングが小胞の荷降ろしまたは小胞放出のメカニズムに関与していることを示唆している。[ 21 ]
神経内分泌細胞であるPC12細胞で全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いた研究により、ミオシンIIがキスアンドランエキソサイトーシス中の過渡的融合孔の調節をサポートすることが示された。[ 22 ] mRFP（モノマー赤色蛍光タンパク質）タグ付き組織およびVenusタグ付き脳組織における正常ミオシンII調節軽鎖（RLC）の過剰発現は放出速度の延長をもたらしたが、ミオシンII RLCの変異型を過剰発現すると放出速度が短縮した。[ 22 ]放出速度の延長は融合孔の閉鎖が遅いことを示しており、ミオシンIIはキスアンドランエキソサイトーシス中に放出される神経伝達物質の量も調節する。
SNAREタンパク質がキスアンドラン型エキソサイトーシスにおいて果たす役割については、多くの学術的な議論が存在する。カルシウム依存性シナプトガミンによって開始されるSNAREタンパク質は、分泌小胞と形質膜の結合を介して小胞融合を媒介する。[ 23 ]小胞がシナプス前膜と融合すると、SNAREがトランス位結合からシス位結合へと遷移し、Munc18-1タンパク質によって促進され、続いてSNAREが解離する。[ 24 ] [ 25 ]このプロセスは不可逆的であると考えられていた。しかし、キスアンドラン型エキソサイトーシスが起こる場合、SNAREタンパク質の可逆的な結合が起こり、キスアンドラン型のエキソサイトーシスを媒介することを示唆する。[ 25 ]キスアンドラン中のSNAREタンパク質の操作は、両者の関係についてより多くの洞察を与える可能性があり、さらなる学術的研究が必要である。