組織ナノトランスフェクション

組織ナノトランスフェクション( TNT ) は、ナノスケールで遺伝子や薬物の貨物を送達またはトランスフェクションできる電気穿孔法ベースの技術です。さらに、TNT は、細胞レベルまたは組織レベルの用途に応じて、細胞のみまたは組織誘導と見なすことができる、スキャフォールドレス組織工学(TE) 技術です。トランスフェクション法では、ナノチャネルを使用して貨物を組織に局所的に送達します。  

貨物の送達方法は、ナノ粒子、ウイルスベクターなどのキャリア、または遺伝子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの物理的アプローチに依存しています。 ^{[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9]}さまざまな方法は、サイズの制約や組織を損傷せずに貨物を効率的に送達する能力によって制限される場合があります。 エレクトロポレーションは、通常は半透性の細胞膜に電場を利用して孔を開き、貨物が通過できるようにする物理的な方法です。 このプロセスでは、電荷を使用して貨物を特定の方向に駆動することができます。

バルクエレクトロポレーション（BEP）は最も一般的なエレクトロポレーション法です。利点は、高スループットと最小限のセットアップ時間です。^[7] BEPの欠点は、細胞膜に電界が不均一に分布し、多くの細胞膜が不可逆的な損傷を受けて閉じることができなくなり、細胞生存率が低下することです。

電気穿孔法を小型化する試みとしては、マイクロエレクトロポレーション（MEP）^[10]やナノチャネルエレクトロポレーション（NEP）^{[11]などがあり、これらはそれぞれ}マイクロ/ナノチャネルを介して貨物を送達する電気穿孔法を採用している。これらの技術は、BEPと比較して送達効率が高く、均一なトランスフェクションが向上し、細胞生存率が向上することが示されている。^[12]

組織ナノトランスフェクションでは、カスタム製作されたナノチャネルアレイを使用して、遺伝子カーゴを皮膚の表面に直接ナノスケールで送達します。切手サイズのチップを皮膚に直接置き、数ミリ秒間電流を誘導して遺伝子カーゴを正確に制御しながら送達します。このアプローチにより、十分な量の再プログラミング因子が単一細胞に送達されるため、強力な遺伝子トランスフェクションおよび再プログラミング方法になる可能性があります。^{[11] [12]}送達されたカーゴは、影響を受けた細胞を最初に幹細胞に変換することなく、目的の細胞タイプに変換します。TNTは新しい技術であり、マウスモデルで線維芽細胞をニューロン様細胞にトランスフェクトし、血管系と灌流を誘導したマウスモデルの虚血を回復することに成功しました。^[13]現在の方法では、製作されたTNTチップを皮膚に配置し、ローディングリザーバーに遺伝子溶液を満たす必要があります。電極（カソード）をウェルに配置し、対電極（アノード）をチップの下の皮内（皮膚内）に配置します。発生した電界が遺伝子を送達する。^[13]

初期のTNT実験では、遺伝子をマウスの皮膚に送達できることが示されました。^[13]これが確認された後、Vierbuchen ^{[14]と協力者が線維芽細胞をニューロンに再プログラムするために使用した遺伝子因子（} ABM ）のカクテルが使用されました。^{[12] [13]これらの因子の送達により、}生体内での再プログラミングが成功し、シグナルが表皮から真皮の皮膚層に伝播することが実証されました。この現象は、細胞外小胞^[15]と、おそらく他の因子 [18]によって媒介されていると考えられています。再プログラミングが成功したかどうかは、組織学および電気生理学的検査を実施して、組織が機能的なニューロンとして動作していることを確認することで判断されました。^[13]

ニューロンを誘導するだけでなく、Gallego-Perezらは、適切な血流がなければ壊死して腐敗する虚血性マウスの四肢の内皮細胞を誘導することにも着手した。特許取得済みのプラスミドカクテル（Etv2、Fli1、Foxc2、またはEFF）を使用して、これらの因子を手術部位の上の組織に送達した。組織学やレーザースペックルイメージングなどのさまざまな方法を使用して、灌流と新しい血管の構築が治療後7日目に早くも検証された。^[13]

この技術は、細胞源を供給するドナーの不足や多能性を誘導する必要性など、現在のアプローチの限界に対抗するために開発されました。^{[14] [15] [16] [17] [18] [19]}生体内での細胞の再プログラミングは、前処理の必要性を回避し、容易に入手できる細胞を利用します。^{[20] [21]}ほとんどの再プログラミング方法は、ウイルスのトランスフェクションに大きく依存しています。^{[22] [23] TNTは、}カプシドサイズの問題を克服し、安全性を高め、決定論的な再プログラミングを向上させることができる非ウイルスアプローチの実装を可能にします。 ^[13]

組織ナノトランスフェクション技術は、生体組織に貨物を効率的かつ無害に送達する方法として開発されました。この技術は、オハイオ州立大学化学生体分子工学部の Lee と Gallego-Perez が細胞再プログラミング用途向けに開発した高スループットナノエレクトロポレーション法に基づいています。Sen (外科/再生医療) は、工学部の Lee と共同でこの技術を生体内組織再プログラミング用途に応用し、Gallego-Perez は 2 つのプログラムの共同フェローの役割を果たしました。開発は、Gallego-Perez (Ph.D)、Lee (Ph.D)、Sen (Ph.D) が主導した、OSU 工学部と医学部の共同作業でした。

この技術は、クリーンルーム技術とフォトリソグラフィー、シリコンウェーハの深部反応性イオンエッチング（DRIE）を使用して製造され、Gallego-Perezら2017に記載されているように、所望の因子をロードするためのリザーバーの裏面エッチングを備えたナノチャネルを作成しました。 ^[13]次に、このチップは、因子をリザーバーからナノチャネルに、そして接触した組織に駆動するための電界を供給できる電源に接続されます。その後、Xuanの支援を受けて、Senは組織ナノトランスフェクションチップの現在のバージョンを開発しました。^[24]