エレクトロポレーション

エレクトロポレーション（電気穿孔法）または電気透過化法は、細胞に電界をかけて細胞膜の透過性を高める技術である。これにより、化学物質、薬物、電極アレイ、またはDNAを細胞内に導入することができる（電気導入とも呼ばれる）。^{[1] [2] [3] [4]}

微生物学では、電気穿孔法は、細菌、酵母、または植物のプロトプラストに新しいコーディング DNA を導入して形質転換するためによく使用されます。細菌と プラスミドを混合すると、電気穿孔法の後にプラスミドを細菌に導入できますが、導入するものによっては、細胞透過性ペプチドまたは細胞スクイーズも使用できます。電気穿孔法は、電気穿孔キュベット内の懸濁細胞に数千ボルト (約 8 kV/cm) を通すことで機能します。^{[2]その後、細胞は分裂して再生されたプラスミドを含む新しい細胞を生成する機会が得られるまで、慎重に取り扱わなければなりません。このプロセスは、}化学的な形質転換よりも細胞膜の透過性を高めるのに約 10 倍効果的ですが、多くの研究室では電気穿孔法に必要な特殊な機器が不足しています。^{[5] [6] [検証が必要]}

エレクトロポレーションは、組織培養細胞、特に哺乳類細胞への外来遺伝子の導入にも非常に効率的です。たとえば、ノックアウトマウスの作成プロセス、腫瘍治療、遺伝子治療、細胞ベースの治療に使用されます。真核細胞に外来DNAを導入するプロセスは、トランスフェクションとして知られています。エレクトロポレーションは、エレクトロポレーションキュベットを使用して懸濁液中の細胞をトランスフェクトするのに非常に効果的です。エレクトロポレーションは、in vivoの組織、子宮内アプリケーション、およびin ovoトランスフェクションに使用するのに効果的であることが証明されています。接着細胞もエレクトロポレーションを使用してトランスフェクトでき​​るため、研究者はトランスフェクション前に細胞をトリプシン処理する代わりに使用できます。ただし、エレクトロポレーションの欠点の1つは、プロセス後に7,000を超える遺伝子の遺伝子発現が影響を受ける可能性があることです。^[7]これは、正確で精密な結果を確保するために遺伝子発現を制御する必要がある研究で問題を引き起こす可能性があります。

バルクエレクトロポレーションは、マイクロインジェクションや遺伝子銃などの物理的送達方法に比べて多くの利点がありますが、細胞生存率が低いなどの制限もあります。エレクトロポレーションの小型化が研究されており、ナノチャネルを介してエレクトロポレーションベースの技術を利用して、最小限の侵襲で細胞に貨物を送達する組織のマイクロエレクトロポレーションとナノトランスフェクションにつながっています。 ^{[8] [9]}

電気穿孔法は細胞融合を誘発するメカニズムとしても利用されてきた。人工的に誘導された細胞融合は、糖尿病などのさまざまな疾患の調査や治療に利用でき、^{[10] [11] [12]}中枢神経系の軸索の再生、^[13]がん免疫療法用の細胞ワクチンなどの望ましい特性を持つ細胞の生成にも利用できる。^[14]しかし、細胞融合の最初のそして最もよく知られている応用は、ハイブリドーマ技術におけるモノクローナル抗体の生産であり、特定の抗体を産生するBリンパ球と骨髄腫（Bリンパ球癌）細胞株を融合させることでハイブリッド細胞株（ハイブリドーマ）が形成される。^[15]

エレクトロポレーションは、細胞溶液に静電場を作り出す専用の器具であるエレクトロポレーターを使用して行われます。細胞懸濁液は、側面に2 つのアルミニウム電極があるガラス製またはプラスチック製のキュベットにピペットで入れられます。細菌のエレクトロポレーションでは、通常、約 50マイクロリットルの懸濁液が使用されます。エレクトロポレーションの前に、この細菌懸濁液を形質転換するプラスミドと混合します。混合物をキュベットにピペットで入れ、電圧と静電容量を設定し、キュベットをエレクトロポレーターに挿入します。このプロセスでは、電極と懸濁液を直接接触させる必要があります。エレクトロポレーションの直後に、1 ミリリットルの液体培地を細菌 (キュベット内またはエッペンドルフチューブ内) に加え、チューブを細菌の最適温度で 1 時間以上インキュベートして細胞の回復とプラスミドの発現を可能にし、その後、寒天培地上で細菌を培養します。

エレクトロポレーションの成功は、プラスミド溶液の純度、特にその塩分含有量に大きく依存します。塩分濃度の高い溶液は放電（アーク放電）を引き起こす可能性があり、これにより細菌の生存率が低下することがよくあります。プロセスをさらに詳しく調査するには、ポレーター装置の出力インピーダンスと細胞懸濁液の入力インピーダンス（塩分含有量など）にさらに注意を払う必要があります。

細胞膜は電流を通すことができないため（イオンチャネルを除く）、電気コンデンサとして機能します。細胞膜を高電圧の電界にさらすと、一時的に破壊され、高分子（DNAなど）が細胞に出入りできるほどの大きさの孔が形成されます。^[16]

さらに、エレクトロポレーションは子宮内注射や手術中に細胞の透過性を高めるためにも使用できます。特に、エレクトロポレーションにより、マウスやラットの細胞に DNA、RNA、shRNA、およびすべての核酸をより効率的に導入できます。生体内エレクトロポレーションの成功は、電圧、繰り返し、パルス、および期間に大きく依存します。発達中の中枢神経系は、核酸の注入のための心室の可視性と分裂細胞の透過性の向上により、生体内エレクトロポレーションに最も効果的です。子宮内注入された胚のエレクトロポレーションは、胚への損傷を最小限に抑えるために、多くの場合、鉗子型電極を使用して子宮壁を通して行われます。^[17]

生体内遺伝子電気導入は1991年に初めて説明され^[18]、今日では遺伝子電気導入に関する多くの前臨床研究が行われています。この方法は、免疫系の障害、腫瘍、代謝障害、単一遺伝子疾患、心血管疾患、鎮痛剤など、さまざまな疾患の潜在的な治療のために、多種多様な治療遺伝子を送達するために使用されています。^{[19] [20] [21]}

不可逆的電気穿孔法に関しては、マウスに移植された悪性皮膚腫瘍の最初の治療は、13匹のマウスのうち12匹で腫瘍の完全除去を達成した科学者グループによって2007年に完了しました。彼らは、皮膚腫瘍を治療するために、2500 V / cmの電界強度で0.3 Hzで100マイクロ秒のパルスを80回送信することでこれを達成しました。^[22]現在、AngioDynamics、Inc.、VoltMed、Inc.を含むいくつかの企業が、臨床環境で不可逆的電気穿孔法に基づく技術の開発と展開を続けています。

電気穿孔法を医療に応用した最初のグループは、ギュスターヴ・ルッシー研究所のルイス・M・ミールが率いた。この研究は、不浸透性高分子と組み合わせた可逆的電気穿孔法の使用を研究した。ナノ秒パルスを人間の細胞にどのように使用できるかを研究した最初の研究は、イースタンバージニア医科大学とオールドドミニオン大学の研究者によって行われ、2003年に発表された。^[23]

電気穿孔法の最初の医療応用は、浸透性の低い抗癌剤を腫瘍結節に導入するために使用されました。^[24]すぐに、遺伝子電気導入も、その低コスト、実現の容易さ、安全性のために特別な関心を集めました。つまり、ウイルスベクターは、DNA導入に使用する場合、免疫原性および病原性の点で重大な制限がある可能性があります。^[25]

不可逆的電気穿孔法は、心筋のごく一部を死滅させる心臓アブレーション療法として使用され、評価されている。これは不整脈の治療に行われる。心臓カテーテルは、 細胞膜に不可逆的な孔を形成し、細胞死をもたらす高電圧の超高速電気パルスの列を送る。これは、熱や冷気を利用して大量の筋肉を死滅させる従来の技術よりも選択性が高いと考えられている。^[26]

豚の実験では、より高い電圧の電気穿孔法によって、狭い範囲内の標的細胞が不可逆的に破壊され、隣接する細胞には影響が及ばないことが分かり、がん、心臓病、その他組織の除去を必要とする病状の新しい治療法として期待されています。^{[27]不可逆電気穿孔法（IRE）はその後、人間のがん治療に効果があることが証明され、}ジョンズホプキンス大学などの外科医が、以前は切除不可能と考えられていた膵臓がんの治療にこの技術を使用しています。^[28]

また、転移性黒色腫患者に対する遺伝子電気導入の初の第I相臨床試験も報告された。^{[29] [30]}インターロイキン-12 （pIL-12） のプラスミドコード遺伝子の電気穿孔法による送達が行われ、安全性、忍容性、治療効果が監視された。研究では、pIL-12による遺伝子電気導入は安全で忍容性が高いと結論付けられた。さらに、治療されていない遠隔転移でも部分的または完全な反応が見られ、全身治療効果が示唆された。これらの結果に基づき、彼らはすでに第II相臨床試験に移行することを計画している。現在、遺伝子電気導入の臨床試験がいくつか進行中であり^[31]、電気パルスによって投与されるDNAワクチンによる免疫の安全性、忍容性、有効性が監視されている。

この方法は全身的ではなく、厳密に局所的なものですが、それでも遺伝子送達のための最も効率的な非ウイルス戦略です。

非熱不可逆電気穿孔法（N-TIRE）と呼ばれる最近の技術は、多くの異なるタイプの腫瘍やその他の望ましくない組織の治療に効果があることが証明されています。この手順は、標的組織の内側または周囲に配置された小さな電極（直径約1mm）を使用して、所定の電圧と周波数で短く反復的な電気バーストを適用します。これらの電気バーストにより、静止膜電位（TMP）が増加し、細胞膜にナノ細孔が形成されます。組織に適用された電気が標的組織の電界閾値を超えると、ナノ細孔の形成により細胞は永久に透過性になります。その結果、細胞は損傷を修復できず、恒常性の喪失により死滅します。^[32] N-TIREは、周囲の組織に熱損傷を与えないという点で、他の腫瘍アブレーション技術とは異なります。

対照的に、可逆的電気穿孔は、電極で印加された電気が標的組織の電界閾値を下回る場合に発生します。印加された電気は細胞の閾値を下回るため、細胞はリン脂質二重層を修復し、通常の細胞機能を継続することができます。可逆的電気穿孔は、通常、薬剤または遺伝子（または通常は細胞膜を透過しない他の分子）を細胞に取り込む治療で行われます。すべての組織が同じ電界閾値を持っているわけではないため、治療前に安全性と有効性を確保するために慎重な計算を行う必要があります。^[33]

N-TIREを使用する大きな利点の1つは、慎重な計算に従って正しく実行された場合、標的組織のみに効果があることです。タンパク質、細胞外マトリックス、血管や神経などの重要な構造はすべてこの治療によって影響を受けず、健康なまま残ります。これにより、回復が早まり、死んだ腫瘍細胞が健康な細胞に迅速に置き換えられます。^[34]

科学者は、処置を行う前に、正確に何をすべきかを慎重に計算し、個々の患者を個別に治療する必要があります。これを行うには、CTスキャンやMRIなどの画像技術を使用して、腫瘍の3D画像を作成するのが一般的です。この情報から、腫瘍の体積を概算し、電極の挿入場所、挿入角度、必要な電圧など、ソフトウェア技術を使用して最善の処置方針を決定することができます。特に脳腫瘍の治療に電極が使用されている場合は、CT装置を使用して処置中に電極を配置することがよくあります。^[35]

全体の手順は非常に迅速で、通常は約5分かかります。これらの手順の成功率は高く^[16]、将来の人間の治療に非常に期待されています。N-TIREを使用する際の欠点の1つは、電極から供給される電気が筋肉細胞を収縮させる刺激を与える可能性があり、状況によっては致命的な結果を招く可能性があることです。したがって、この手順を実行する際には麻痺剤を使用する必要があります。このような研究で使用されている麻痺剤は成功しています^[要出典]。ただし、麻酔薬を使用する場合は、わずかではありますが常に何らかのリスクがあります。

最近では、高周波不可逆電気穿孔法（H-FIRE）と呼ばれる技術が開発されている。この技術では、低周波の単極電気バーストではなく、高周波の双極電気バーストを電極で適用する。このタイプの手順は、N-TIREと同様に腫瘍アブレーションに効果がある。しかし、H-FIREは患者の筋肉収縮を引き起こさないため、麻痺剤を必要としないという明確な利点がある。^[36]さらに、H-FIREは、高周波での組織の電気的特性の差が少ないため、より予測可能なアブレーションを生み出すことが実証されている。^[37]

エレクトロポレーションは、細胞膜を一時的に透過性にする短く強力な電気パルスを適用することで、薬剤や遺伝子を細胞に送達するのにも使用できます。これにより、細胞膜を通過しない分子の輸送が可能になります。この手順は、輸送される分子が化学療法剤である場合は電気化学療法と呼ばれ、輸送される分子がDNAである場合は遺伝子電気伝達と呼ばれます。カロリンスカ研究所とオックスフォード大学の科学者は、エクソソームのエレクトロポレーションを使用して、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤、タンパク質を全身（血液）に注入した後、ニューロンに特異的に送達します。これらのエクソソームは血液脳関門を通過できるため、このプロトコルは中枢神経系への薬剤の送達不良の問題を解決し、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳腫瘍などの病気を治療できる可能性があります。^[38]

細菌の形質転換は、一般的にバイオテクノロジーや医療の目的に必要な特定のタンパク質を大量に生産する最も簡単な方法です。遺伝子の電気伝達は非常にシンプルで迅速かつ効果的な技術であるため、最初は他の形質転換手順の非常に便利な代替手段となりました。^[39]

最近の研究では、電気穿孔法の前に細胞膜を前処理するために衝撃波を使用できることが示されています。^{[40] [41]}この相乗的な戦略により、外部電圧の必要性が減り、より大きな孔が作られることが示されています。また、衝撃波を適用することで、目的の膜部位をターゲットにすることができます。この手順により、孔のサイズを制御できます。

電気穿孔法は、疎水性二重膜コアを受動的に拡散することは決してないDNAなどの大型の高電荷分子を細胞に導入することを可能にする。^[2]この現象は、そのメカニズムが膜にnmスケールの水で満たされた穴を作ることであると示している。^[42]電気孔は、液滴界面二重膜^[43]や巨大単層小胞^[44]などの脂質二重膜モデルで光学的に画像化されているが、アクチンネットワークなどの細胞骨格タンパク質を巨大単層小胞に追加すると、目に見える電気孔の形成が妨げられるようである。^[45]アクチンネットワークが細胞膜透過性を調節するという実験的証拠も現れている。^[46]電気穿孔法と誘電破壊はどちらも電界の印加によって生じるが、そのメカニズムは根本的に異なる。誘電破壊では、バリア材料がイオン化され、導電経路が形成される。したがって、材料の変化は化学的性質である。対照的に、電気穿孔法では脂質分子は化学的に変化せず、単に位置がシフトし、水で満たされた二重層を通る導電経路として機能する細孔が開きます。

電気穿孔は、細胞膜上の各点における局所的な膜貫通電圧に依存する動的な現象である。一般に、与えられたパルス持続時間と形状に対して、電気穿孔現象の発現のための特定の膜貫通電圧閾値（0.5 V ～ 1 V）が存在すると考えられている。これにより、電気穿孔の電界強度閾値（E _{th ）が定義される。つまり、E ≧ E th}の領域内の細胞のみが電気穿孔される。第 2 の閾値（E _ir）に達するかそれを超えると、電気穿孔によって細胞の生存能力が損なわれ、不可逆的な電気穿孔（IRE）となる。 [ ^47]

電気穿孔法は、いくつかの異なる段階を持つ多段階のプロセスです。^{[48] [49]}まず、短い電気パルスを適用する必要があります。一般的なパラメータは、膜全体で 1 ミリ秒未満で 300～400 mV です (注: 細胞実験で使用される電圧は、バルク溶液に対して長い距離にわたって適用されるため、通常ははるかに大きいため、実際の膜全体に生じる電界は、適用されたバイアスのほんの一部にすぎません)。この電位を適用すると、膜は周囲の溶液からのイオンの移動によってコンデンサのように充電されます。臨界電界が達成されると、脂質形態の急速な局所的再配置が起こります。結果として生じる構造は、導電性ではありませんが、導電性の孔の形成に急速につながるため、「プレ孔」であると考えられています。^[50]このようなプレ孔の存在の証拠は、主に孔の「ちらつき」から得られ、これは導電性と絶縁性の状態間の遷移を示唆しています。^[51]これらのプレポアは小さな（約3Å）疎水性欠陥であると示唆されている。この理論が正しければ、導電性状態への移行は、脂質ヘッドが折り重なって親水性界面を形成する、ポアエッジの再配置によって説明できる。最終的に、これらの導電性ポアは治癒して二重層を再密封するか、拡大して最終的に破裂するかのいずれかになる。結果の運命は、臨界欠陥サイズを超えたかどうかに依存し^[52]、それは印加電界、局所的な機械的応力、および二重層エッジエネルギーに依存する。

十分な強度の電気パルスを細胞に印加すると、膜間電位差が増加し、膜の不安定化が引き起こされる。細胞膜の透過性が増加し、通常は透過しない分子が細胞内に入る。^{[53] [54]} 遺伝子電気導入のメカニズムはまだ完全には解明されていないが、DNAの導入は陰極に面した膜の部分でのみ起こり、トランスフェクションを成功させるには、細胞へのDNAの電気泳動による移動、膜へのDNAの挿入、膜を越えた転座、核へのDNAの移動、核膜を越えたDNAの移動、そして最後に遺伝子発現といういくつかのステップが必要であることが示されている。^[55]遺伝子電気導入の効率に影響を与える要因は多数あり、例えば、温度、電気パルスのパラメータ、DNA濃度、使用する電気穿孔緩衝液、細胞の大きさ、およびトランスフェクトされた遺伝子を発現する細胞の能力などである。^[56]生体内遺伝子電気導入では、細胞外マトリックスを通じたDNAの拡散、組織の特性、および組織全体の導電性も重要である。^[57]

1960年代には、外部電場を印加することで、細胞の両極に大きな膜電位を生成できることが知られていました。1970年代には、膜電位が臨界レベルに達すると膜が破壊され、回復できることが発見されました。^[58] 1980年代までに、この開口部はさまざまな材料/分子を細胞に導入するために使用されました。^[59]