制限酵素断片長多型

分子生物学において、制限断片長多型( RFLP ) は、多型、集団、種として知られる相同 DNA配列の変異を利用したり、配列内の遺伝子の位置を正確に特定したりする手法です。この用語は、制限酵素部位の異なる位置を通じて検出される多型自体を指す場合もあれば、そのような違いを説明できる関連する実験手法を指す場合もあります。RFLP 分析では、 DNA サンプルを 1 つ以上の制限酵素で断片に消化し、得られた制限断片をゲル電気泳動でサイズに応じて分離します。

RFLP 分析は、安価なDNA 配列決定技術の出現により現在ではほぼ廃れていますが、広く応用できるほど安価な最初のDNA プロファイリング技術でした。RFLP 分析は、ゲノム マッピング、遺伝性疾患の遺伝子の位置特定、疾患リスクの判定、および父子鑑定における初期の重要なツールでした。

RFLP を検出するための基本的な技術は、制限酵素を用いて DNA サンプルを断片化することである。制限酵素は、制限消化と呼ばれるプロセスで認識された短い特定の 配列がある場所ではどこでも、 DNA 分子を選択的に切断することができる。消化によって生成された DNA 断片は、アガロースゲル電気泳動と呼ばれるプロセスによって長さによって分離され、サザンブロット法によって膜に移される。次に、標識されたDNA プローブと膜のハイブリダイゼーションによって、プローブに相補的な断片の長さが決定される。制限断片長多型は、検出された断片の長さが個人間で異なり、同一ではない配列相同性を示している場合に発生すると言われている。各断片の長さは、実際にコード領域を含むかどうかに関係なく、対立遺伝子とみなされ、その後の遺伝子分析に使用することができる。

特定の制限断片のサイズが変化する一般的なメカニズムは 2 つあります。最初の図では、ゲノムの小さなセグメントがDNAプローブ (太い線) によって検出されています。対立遺伝子Aでは、ゲノムは 3 つの近くの部位 (三角形) で制限酵素によって切断されますが、プローブによって検出されるのは右端の断片だけです。対立遺伝子aでは、制限部位 2 が突然変異によって失われているため、プローブは部位 1 から 3 にわたる大きな融合断片を検出するようになりました。2 番目の図は、この断片サイズの変動がサザンブロットでどのように見えるか、および各対立遺伝子 (個人ごとに 2 つ) が家族のメンバーでどのように継承されるかを示しています。

3 番目の概略図では、プローブと制限酵素は、可変数タンデムリピート(VNTR) セグメント (概略図のボックス) を含むゲノム領域を検出するように選択されています。アレルcでは、VNTR に 5 つのリピートがあり、プローブは 2 つの制限部位間のより長いフラグメントを検出します。アレルdでは、VNTR に 2 つのリピートしかないため、プローブは同じ 2 つの制限部位間のより短いフラグメントを検出します。挿入、欠失、転座、逆位などの他の遺伝プロセスも、多型を引き起こす可能性があります。RFLP テストでは、短いタンデムリピート(STR) テストよりもはるかに大きな DNA サンプルが必要です。

ゲノムにおける RFLP 変異の分析は、かつてはゲノムマッピングと遺伝性疾患の分析に不可欠なツールでした。研究者が特定の疾患遺伝子の染色体位置を最初に決定しようとする場合、その疾患に罹患している家族のメンバーの DNA を分析し、疾患と同様の遺伝パターンを示す RFLP 対立遺伝子を探します (遺伝的連鎖を参照)。疾患遺伝子が特定されると、他の家族の RFLP 分析により、誰がその疾患のリスクがあるか、または誰が変異遺伝子のキャリアである可能性が高いかが明らかになります。RFLP テストは、ゲノム内の固有のパターンを分析することにより、生物の識別と区別に使用されます。また、制限部位間の遺伝子座における組み換え率の特定にも使用されます。

RFLP 分析は、犯罪現場から回収されたサンプルの識別、父子の判定、動物集団の遺伝的多様性や繁殖パターン の特徴付けに役立つ遺伝子指紋法の初期手法の基礎でもありました。

しかし、RFLP分析の技術は時間がかかり、面倒です。大量のサンプルDNAが必要であり、プローブの標識、DNAの断片化、電気泳動、ブロッティング、ハイブリダイゼーション、洗浄、オートラジオグラフィーを組み合わせたプロセスは、完了するまでに最大1か月かかることがあります。オリゴヌクレオチドプローブを使用するRFLP法の限定版は、1985年に報告されました。^[1]ヒトゲノムプロジェクトの結果により、RFLPマッピングの必要性は大幅になくなり、そのプロジェクトで多くの一塩基多型（SNP）が特定されたこと（および多くの疾患遺伝子と突然変異が直接特定されたこと）により、RFLP疾患連鎖解析の必要性もなくなりました（SNPジェノタイピングを参照）。VNTRアレルの解析は継続されていますが、現在は通常、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法で実行されます。たとえば、DNAフィンガープリントの標準プロトコルでは、12を超えるVNTRの パネルのPCR解析が行われます。

RFLP は今でもマーカー補助選抜に使用されています。末端制限断片長多型 (TRFLP または T-RFLP と呼ばれることもあります) は、当初は混合種のサンプル内の細菌群集を特徴付けるために開発された手法です。この手法は、土壌菌類を含む他のグループにも適用されています。TRFLP は、蛍光タグでラベル付けされたプライマー ペアを使用して DNA を PCR 増幅することによって機能します。PCR 産物は、次に RFLP 酵素を使用して消化され、結果として得られたパターンは DNA シーケンサーを使用して視覚化されます。結果は、TRFLP プロファイル内のバンドまたはピークを単純にカウントして比較するか、1 つ以上の TRFLP 実行からのバンドを既知の種のデータベースと照合することによって分析されます。TRFLP プロファイルのバンドのマッチング、比較、およびデータベース化のプロセスを自動化するために、さまざまなソフトウェア ツールが開発されています。^[2]

この技術は、温度勾配ゲル電気泳動法や変性勾配ゲル電気泳動法(TGGE および DGGE) といくつかの点で似ています。

RFLP に直接関係する配列の変化も、PCR によってより迅速に分析できます。増幅は変更された制限部位をまたいで行われ、産物は制限酵素で消化されます。この方法は、切断増幅多型配列(CAPS) と呼ばれています。または、増幅されたセグメントは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO) プローブによって分析できます。このプロセスは、多くの場合、単純なドット ブロットによって実行できます。

• 増幅断片長多型（AFLP）
• RAPD
• STR分析

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml