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分子生物学において、核酸の定量は、混合物中に存在するDNAまたはRNAの平均濃度と純度を決定するために一般的に行われます。核酸を用いる反応では、最適な性能を発揮するために、特定の量と純度が求められることがよくあります。現在までに、科学者が溶液中の核酸（DNAやRNAなど）の濃度を定量化するために用いている主な手法は2つあります。それは、分光光度法による定量と、DNA色素存在下でのUV蛍光標識法です。
DNAやRNAを定量化するために最も一般的に使用される方法の1つは、分光光度計を使用した分光光度分析です。[ 1 ]分光光度計は、混合物中に存在する核酸DNAまたはRNAの平均濃度と純度を決定することができます。
分光光度分析は、核酸が特定のパターンで紫外線を吸収するという原理に基づいています。DNAと RNAの場合、サンプルに波長260ナノメートル（nm）の紫外線を照射し、光検出器でサンプルを透過した光を測定します。紫外線の一部は透過し、一部はDNA/RNAに吸収されます。サンプルに吸収される光が多いほど、サンプル中の核酸濃度が高くなります。その結果、光検出器に到達する光量が少なくなり、吸光度（OD）が高くなります。
ベール・ランバートの法則を用いると、吸収される光の量と吸収分子の濃度を関連付けることができる。波長 260 nm では、二本鎖 DNA (dsDNA) の 平均消光係数は 0.020 (μg/mL) −1 cm −1、一本鎖 DNA (ssDNA) は 0.027 (μg/mL) −1 cm −1、一本鎖 RNA (ssRNA) は 0.025 (μg/mL) −1 cm −1であり、短い一本鎖オリゴヌクレオチドの場合は長さと塩基組成に依存する。したがって、二本鎖 DNA の場合、吸光度(A) が 1 は濃度 50 μg/mL に相当する。この計算方法は、A が少なくとも 2 まで有効である。[ 2 ]オリゴヌクレオチドの場合は、より正確な消光係数が必要になる場合がある。これらは最近傍モデルを使用して予測できます。[ 3 ]
光学密度（OD）[ 4 ] は、以下の式から算出される。
実際には、DNAやRNAを含まないサンプルは紫外線を全く吸収しないため、OD値は0になるはずです。
光学密度 = Log (100/100) = 0
DNAまたはRNAの濃度を決定するために分光光度分析を使用する場合、標準曲線を必要とせずに未知の濃度を決定するためにBeer-Lambertの法則が使用されます。本質的に、Beer-Lambertの法則は、吸収された光の量と吸収分子の濃度を関連付けることを可能にします。ODを未知の核酸サンプルの濃度に変換するには、次の吸光度単位から核酸濃度への変換係数が使用されます。[ 5 ]
光路長 10mmを使用する場合は、OD値に変換係数を掛けるだけで濃度を求めることができます。例えば、OD値2.0のdsDNAサンプルは、濃度100μg/mLのサンプルに相当します。
光路長が10mmより短い場合、得られるOD値は光路長の10分の1に減少します。上記の例で 光路長が3mmの場合、100μg/mLサンプルのOD値 は0.6に減少します。濃度を10mm相当に正規化するには、次の操作を行います。
0.6 OD × (10/3) * 50 μg/mL = 100 μg/mL
ほとんどの分光光度計では、核酸の種類と光路長を選択できるため、結果として得られる濃度は、ベールの法則 の原理に基づいて、10 mmの光路長に正規化されます。
「A260単位」は核酸の量を測る単位として用いられます。1 A260単位とは、1 mL中に含まれ、OD値が1となる核酸の量です。同じ換算係数が適用されるため、以下の文脈で使用できます。
核酸サンプルが他の分子（タンパク質、有機化合物など）で汚染されることはよくある。核酸定量に分光光度分析を使用する二次的な利点は、260 nm:280 nm の計算を使用してサンプルの純度を決定できることである。260 nm と 280 nm の吸光度の比 (A 260/280 ) は、核酸の純度を評価するために使用される。純粋な DNA の場合、A 260/280 は一般的に約 1.8 と考えられているが、元の Warburg 論文の数値エラーにより、60% のタンパク質と 40% の DNA の混合物に翻訳される可能性があると主張されている。[ 6 ]純粋な RNA の A 260/280の比は約 2.0 である。タンパク質は 280 nm で吸収するため、これらの比は、核酸分離プロセスから残ったタンパク質汚染の量を評価するためによく使用される 。
260 nm と 280 nmの吸光度の比は、タンパク質 (特に芳香族アミノ酸) が 280 nmの光を吸収するため、タンパク質溶液の DNA 汚染を評価するためによく使用されます。 [ 2 ] [ 7 ]しかし、その逆は真ではありません。核酸溶液の 260:280 比に有意な影響を与えるには、比較的多くのタンパク質汚染が必要です。[ 2 ] [ 6 ]
260:280の比率は、タンパク質中の核酸汚染に対して高い感度を示す。
260:280の比率は核酸中のタンパク質汚染に対する感度が低い（表はRNAについて示しており、100% DNAの場合は約1.8である）。
この違いは、核酸の260 nmおよび280 nmにおける質量減衰係数がタンパク質のそれよりもはるかに高いことに起因します。そのため、タンパク質の濃度が比較的高い場合でも、タンパク質が260 nmおよび280 nmの吸光度に与える影響は比較的小さくなります。260:280比ではタンパク質混入を確実に評価することはできませんが、これは同時に、DNA量の推定における誤差も小さいことを意味します。
試料スペクトルの分析は、試料の純度に問題があるかどうかを特定するのに役立つ可能性がある。
DNAおよびRNA濃度を評価する別の方法として、蛍光タグを用いてサンプルを標識する方法があります。蛍光タグとは、核酸に結合して選択的に蛍光を発する色素（例えば臭化エチジウム）の強度を測定するために使用される蛍光色素です。この方法は、濃度が低すぎて分光光度法で正確に測定できない場合や、260 nmで吸収する汚染物質によって分光光度法による正確な定量が不可能な場合に有効です。DNAおよびRNAの蛍光定量の利点は、分光光度分析よりも感度が高いことです。ただし、感度の向上は、サンプルあたりのコストの上昇とサンプル調製プロセスの長期化という代償を伴います。
これには主に 2 つのアプローチ方法があります。「スポット法」では、サンプルをアガロースゲルまたはプラスチックラップに直接置きます。蛍光色素はアガロースゲル中に存在するか、プラスチックフィルム上のサンプルに適切な濃度で添加されます。既知濃度のサンプル群をサンプルの横にスポットします。次に、これらの既知濃度の蛍光と比較することによって、未知のサンプルの濃度を推定します。あるいは、サンプルを既知濃度のサンプルとともにアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルに通すこともできます。スポットテストと同様に、蛍光強度を既知サンプルと比較することによって濃度を推定します。[ 2 ]
サンプル量がマイクロプレートやキュベットを使用できるほど十分な量であれば、色素を負荷したサンプルは蛍光光度計で定量することもできます。最小サンプル量は0.3 μLから始まります。[ 10 ]
現在までに、260 nm/280 nm分光光度計を用いた方法と同様の、DNAサンプル中のタンパク質混入を判定するための蛍光法は存在しない。