DNAコード化化学ライブラリ

DNA エンコード化学ライブラリ( DECL ) は、これまでにない規模の小分子化合物のコレクションを合成およびスクリーニングするための技術です。DECL は、コンビナトリアル化学と分子生物学の分野をつなぐために医薬品化学で使用されています。DECL 技術の目的は、創薬プロセス、特にターゲット検証やヒット特定などの初期段階の創薬活動を加速することです。

DECL 技術では、識別バーコードとして機能し、場合によっては化学合成を指示および制御する短いDNAフラグメントに化合物または構成要素を結合します。この技術により、通常は固定化されたタンパク質ターゲット上で、親和性選択によるライブラリの大量作成と照会が可能になります。最近、DNA エンコード ライブラリ (DEL) をスクリーニングするための均一な方法が開発されました。これは、油中水エマルジョン技術を使用して、単一のチューブ アプローチで個々のリガンド-ターゲット複合体を分離、カウント、および識別するものです。ハイスループット スクリーニングなどの従来のスクリーニング手順とは対照的に、結合剤の識別には生化学アッセイは必要なく、原理的には、従来のスクリーニング技術ではこれまで対処が困難であったさまざまなタンパク質に対する結合剤の分離が可能です。したがって、ターゲット固有の分子化合物の一般的な発見に加えて、薬理学的に重要ではあるがこれまで「薬にできない」ターゲット タンパク質に対する結合剤が利用可能になることで、これまで治療できなかった疾患に対する新薬を開発する新しい可能性が開かれます。ヒットの活性を最初に評価する必要がなくなることで、特定された高親和性バインダーの多くが、選択されたヒットの独立した分析で活性であることが示され、高品質のヒットと医薬品のリードを特定する効率的な方法が提供されることが期待されます。

最近まで、研究室における分子進化の応用は生体分子を含むディスプレイ技術に限られており、小分子リードの発見はこの生物学的アプローチの域を超えていると考えられていました。DELはディスプレイ技術の分野を小分子などの非天然化合物を含むように広げ、分子進化と自然選択の応用を所望の活性および機能を有する小分子化合物の同定にまで広げました。 DNAでコード化された化学ライブラリーは、抗体ファージディスプレイ技術、酵母ディスプレイ、mRNAディスプレイ、アプタマーSELEXなどの生物学的ディスプレイ技術と類似しています。抗体ファージディスプレイでは、抗体は結合した抗体をコードする遺伝子を有するファージ粒子に物理的に連結されており、これは「表現型」（タンパク質）と「遺伝子型」（タンパク質をコードする遺伝子）の物理的連結に相当します。^{[1]ファージディスプレイされた抗体は、}分子進化を模倣することにより、すなわち（固定化されたタンパク質標的に対する）選択、増幅、および翻訳のラウンドを経ることによって、大規模な抗体ライブラリーから単離することができます。^[2] DELでは、小分子を識別DNAコードにリンクすることで、結合分子の容易な識別が可能になります。DELは、選択された固定化標的タンパク質に対する親和性選択手順にかけられ、その後、非結合分子は洗浄ステップで除去され、結合分子はその後ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅され、DNAコードによって識別されます（例：DNAシーケンシング）。進化ベースのDELテクノロジーでは、抗体ファージディスプレイなどの生物学的ディスプレイシステムと同様に、選択、PCR増幅、翻訳のラウンドを実行することでヒットをさらに濃縮できます。これにより、はるかに大きなライブラリで作業できるようになります。

「化合物の多成分混合物を単一のプロセスで合成し、これも単一のプロセスでスクリーニングする」。これは、1982年にフルカ・ア教授（ハンガリー、ブダペストのエトヴェシュ・ロラーンド大学）によって発明されたコンビナトリアル化学の原理であり、同年に公証された文書で、コンビナトリアルライブラリの合成方法とデコンボリューション戦略の方法を含めて説明されました。^[3]この発明につながった動機は2002年に発表されました。 ^[4] DNAエンコード化学ライブラリ（DECL）はコンビナトリアル化学の原理によって合成され、その用途と明らかに一致しています。^[5]

DNAエンコードの概念は、1992年にシドニー・ブレナーとリチャード・ラーナーが発表した理論論文で初めて説明されました。この論文では、化学的に合成された実体の各分子を、並行して構築された特定のオリゴヌクレオチド配列にリンクし、このエンコード遺伝子タグを使用して活性化合物を識別および濃縮することが提案されました。 ^[6] 1993年に、このアプローチの最初の実用的な実装がJ・ニールセン、S・ブレナー、K・ジャンダによって発表され、同様にMA・ギャロップのグループによっても発表されました。[ ^{7] [8]ブレナーとジャンダは、ヘテロポリマー化合物と適切なオリゴヌクレオチド配列を同じビーズ上で「スプリット＆プール」ベースの方法で交互に並行し}て組み合わせ合成することにより、個々のエンコードされたライブラリメンバーを生成することを提案しました（以下を参照）。^[7]

保護されていないDNAは従来の反応条件の狭い範囲に限定されるため、1990年代末までは、主に不便な固相DNA合成を避け、高スループット方式で容易にスクリーニング可能なコンビナトリアルライブラリを作成するために、いくつかの代替エンコード戦略（ MSベースの化合物タグ付け、ペプチドエンコード、ハロ芳香族タグ付け、第二級アミン、半導体デバイスによるエンコードなど）が想定されていました。 ^[9]しかし、DNAの選択的増幅可能性はライブラリのスクリーニングを大幅に容易にし、この前例のないサイズの有機化合物ライブラリのエンコードに不可欠になります。その結果、2000年代初頭にDNAコンビナトリアルケミストリーは復活を遂げました。

2000 年代初頭には、DEL 技術のいくつかの独立した開発が導入されました。これらの技術は、分子進化が可能な非進化ベースおよび進化ベースの DEL 技術の 2 つの一般的なカテゴリに分類できます。最初のカテゴリでは、既製の試薬を使用できるという利点があり、そのためライブラリの生成がかなり簡単に行えます。ヒットは DNA シーケンシングによって特定できますが、DNA の翻訳、したがって分子進化はこれらの方法では実行できません。Praecis Pharmaceuticals (現在は GlaxoSmithKline が所有)、Nuevolution (デンマーク、コペンハーゲン) の研究者によって開発された分割アプローチとプール アプローチ、および D. Neri 教授 (スイス、チューリッヒ薬学研究所) の研究室で開発されたエンコード自己組織化化学 (ESAC) 技術がこのカテゴリに分類されます。ESAC 技術は、フラグメント ベースのヒット発見に似たコンビナトリアル自己組織化アプローチであるという点で際立っています (図 1b)。ここでは、DNA アニーリングによって個別のビルディング ブロックの組み合わせをサンプリングできますが、それらの間に化学反応は発生しません。進化ベースの DEL テクノロジーの例としては、DR Halpin 教授と PB Harbury 教授 (スタンフォード大学、カリフォルニア州スタンフォード) が開発した DNA ルーティング、D. Liu教授(ハーバード大学、マサチューセッツ州ケンブリッジ) が開発し Ensemble Therapeutics (マサチューセッツ州ケンブリッジ) が商品化した DNA テンプレート合成、および Vipergen (デンマーク、コペンハーゲン) が開発し商品化した YoctoReactor テクノロジー^[10] があります。これらのテクノロジーについては、以下でさらに詳しく説明します。DNA テンプレート合成と YoctoReactor テクノロジーでは、ライブラリー アセンブリの前に化学ビルディング ブロック (BB) を DNA オリゴヌクレオチド タグに事前に結合させる必要があるため、ライブラリー アセンブリの前により多くの事前作業が必要になります。さらに、DNA タグ付き BB により、合成された化合物の遺伝コードの生成が可能になり、遺伝コードの人工的な翻訳が可能になります。つまり、BB は PCR 増幅された遺伝コードによって呼び出すことができ、ライブラリー化合物を再生することができます。これにより、ダーウィンの自然選択と進化の原理を、選択、増幅、翻訳のサイクルを通じて、生物学的表示システムに直接類似した小分子選択に適用することが可能になります。

コンビナトリアル ライブラリは、単一の段階的なプロセスで合成される特殊な多成分化合物混合物です。これは、個々の化合物のコレクションや、並列合成によって準備された一連の化合物とは異なります。コンビナトリアル ライブラリには重要な機能があります。

合成には混合物が使用されます。混合物を使用すると、プロセスの非常に高い効率が保証されます。両方の反応物が混合物である可能性がありますが、実用的な理由から、スプリットミックス手順が使用されます。つまり、1つの混合物をBBと結合する部分に分割します。^{[11] [12]}混合物は非常に重要であるため、合成で混合物を使用しないコンビナトリアルライブラリは存在せず、プロセスで混合物が使用されると、必然的にコンビナトリアルライブラリが形成されます。

ライブラリのコンポーネントは、ほぼ等しいモル量で存在する必要があります。これを可能な限り近づけるために、混合物を均等に分割し、プールした後、徹底的に混合する必要があります。

″ 成分の構造が不明であるため、スクリーニングではデコンボリューション法を使用する必要があります。このため、エンコード方法が開発されました。エンコード分子は、結合した BB とその配列を記録する固体支持体のビーズに取り付けられます。これらの方法の 1 つは、DNA オリゴマーによるエンコードです。

化合物混合物全体を 1 回のプロセスでスクリーニングできることは、コンビナトリアル ライブラリの注目すべき特徴です。

合成とスクリーニングはどちらも非常に効率的な手順であるため、医薬品研究でコンビナトリアルライブラリを使用すると莫大な節約につながります。

固相コンビナトリアル合成では、各ビーズに単一の化合物のみが形成されます。このため、ライブラリ内のコンポーネントの数は、固体支持体のビーズの数を超えることはできません。つまり、このようなライブラリ内のコンポーネントの数は限られています。この制約は、Harbury と Halpin によって排除されました。彼らの DEL 合成では、固体支持体が省略され、BB はエンコードされた DNA オリゴマーに直接結合されます。^[13]この新しいアプローチは、DNA エンコードされたコンビナトリアルライブラリ (DECL) のコンポーネントの数を実質的に無制限に増やすのに役立ちます。

DNAコード化化学ライブラリーの合成にコンビナトリアルケミストリーを適用するために、スプリット＆プールアプローチが追求された。^{[11] [12]最初に、それぞれが特定のコード配列を含むユニークなDNA}オリゴヌクレオチドのセット（n）が、対応する小さな有機分子のセットに化学的に結合される。その結果、オリゴヌクレオチド結合化合物は混合（「プール」）され、いくつかのグループ（ m ）に分割（「スプリット」）される。適切な条件下で、2番目のビルディングブロックセット（m）が最初のセットに結合され、2番目の変更をコードする別のオリゴヌクレオチドが酵素的に導入され、その後再び混合される。この「スプリット＆プール」ステップは、コンビナトリアル方式でライブラリーサイズを各ラウンドで増加させながら（つまり（n x m）^r ） 、何回も繰り返すことができる（r）。あるいは、「スプリット＆プール」法で準備されたライブラリーをコード化するためにペプチド核酸が使用されている。^[14] PNAエンコーディングの利点は、標準的なSPPSで化学反応を行うことができることである。^[15]

DNA コード化ライブラリーの構築に有望な戦略として、ライブラリー合成の「コア構造」となるオリゴヌクレオチドに共有結合した多機能ビルディングブロックの使用が挙げられます。「プール アンド スプリット」方式で、一連の多機能スキャフォールドが一連の適切な反応パートナーと直交反応を起こします。各反応ステップの後、元の DNA「コア構造」に DNA セグメントを酵素で付加することで、修飾のアイデンティティがコード化されます。^{[16] [17] DNA フラグメントに共有結合した}N保護アミノ酸を使用すると、適切な脱保護ステップの後、一連のカルボン酸とのアミド結合の形成、またはアルデヒドとの還元アミノ化が可能になります。同様に、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの 5' 末端でライブラリー構築のスキャフォールドとして使用されるジエンカルボン酸は、さまざまなマレイミド誘導体とのディールス・アルダー反応にかけることができます。目的の反応ステップが完了すると、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングとそれに続くクレノウ充填DNA重合によってオリゴヌクレオチドに追加された化学部分の同一性が確立され、二本鎖DNA断片が得られる。上記の合成およびエンコード戦略により、2セットの「ビルディングブロック」を含む最大10 ^{4 個}のメンバー化合物のサイズのDNAエンコードライブラリを容易に構築できる。しかし、非常に大きなDNAエンコードライブラリ（最大10 ⁶個の化合物を含む）の構築とエンコードのために、少なくとも3つの独立した化学部分セットを3官能基コアビルディングブロックに段階的に追加することも考えられる。^[16]（図2）

エンコードされた自己組織化化学（ESAC ）ライブラリは、一定の相補的ハイブリダイゼーションドメインを含むxメンバー（例：10 ³ ）のサイズの2つのサブライブラリが、ハイブリダイゼーション後に、 x ²の均一に表現されたライブラリメンバー（例：10 ⁶）の複雑さを持つコンビナトリアルDNA二重鎖ライブラリを生成できるという原理に基づいています。 ^[18]各サブライブラリメンバーは、可変コード領域を含むオリゴヌクレオチドと、その両端に一定のDNA配列があり、オリゴヌクレオチドの末端に適切な化学修飾が施されています。^[18] ESACサブライブラリは、少なくとも4つの異なる実施形態で使用できます。^[18]

• サブライブラリは相補的なオリゴヌクレオチドとペアにして、親和性に基づく選択実験のために共有結合した単一の化合物を表示する DNA エンコード ライブラリとして使用できます。
• サブライブラリは、ターゲットに対する既知のバインダーを表示するオリゴヌクレオチドとペアリングできるため、親和性成熟戦略が可能になります。
• 2 つの個別のサブライブラリを組み合わせて組み立て、二座結合分子のde novo識別に使用できます。
• 3 つの異なるサブライブラリを組み合わせて、組み合わせ三重鎖ライブラリを形成できます。

親和性に基づく選択から分離された優先的な結合剤は、PCR増幅され、相補的オリゴヌクレオチド マイクロアレイ^[19]上でデコードされるか、コードの連結、サブクローニングおよび配列決定によってデコードされる。^[18]個々の構成要素は、最終的に適切なリンカーを使用して結合され、薬物のような高親和性化合物を生成することができる。リンカーの特性（長さ、柔軟性、形状、化学的性質、溶解性など）は、結果として得られる結合剤の結合親和性と化学的性質に影響を与える。（図3）

600メンバーのESACライブラリのHSAに対するバイオパニング実験により、4-( p-ヨードフェニル)ブタン酸部分を単離することができました。この化合物は、一連のポータブルアルブミン結合分子と、現在臨床評価中の最近開発されたフルオレセイン血管造影剤であるアルブフルオールのコア構造を表しています。^[20]

ESAC技術は、ウシトリプシンの強力な阻害剤の単離や 、生理的および病理的な組織リモデリングプロセス、ならびに関節炎や転移などの疾患プロセスに関与するマトリックスメタロプロテアーゼであるストロメリシン-1（MMP-3 ）の新規阻害剤の同定に使用されています。^[21]

2004年、DRハルピンとPBハーバーリーは、DNAエンコードライブラリの構築のための新しい興味深い方法を発表しました。DNA結合テンプレートは、ライブラリコンポーネントの「スプリットアンドプール」合成のインフラストラクチャのエンコードとプログラミングの両方に初めて役立ちました。^[22]ハルピンとハーバーリーの設計により、ファージディスプレイ技術と完全に類似した、選択、 PCR増幅、および小さな有機分子による多様化の交互ラウンドが可能になりました。DNAルーティング機構は、樹脂結合アンチコドンを備えた一連の接続された列で構成されており、ハイブリダイゼーションによってDNAテンプレートの集団を配列特異的に空間的に異なる場所に分離できます。^[22]このスプリットアンドプールプロトコルに従って、 10 ^{6メンバーのDNAエンコード}ペプチドコンビナトリアルライブラリが生成されました。^[23]

2001年、デイビッド・リューと同僚らは、相補的DNAオリゴヌクレオチドが、低濃度の溶液中では効率的に進行しない特定の合成反応を補助するために使用できることを示した。^{[24] [25]} DNAヘテロ二本鎖は、2本のDNA鎖の末端に現れる化学基間の反応を加速するために使用された。さらに、二分子反応を加速する「近接効果」は、距離に依存しないことが示された（少なくとも30ヌクレオチドの距離内）。^{[24] [25]}配列プログラムされた方法で、1つの化学反応基を持つオリゴヌクレオチドが、異なる反応性化学基を持つ相補的オリゴヌクレオチド誘導体とハイブリダイズされた。 DNAハイブリダイゼーションによってもたらされる近接性により、オリゴヌクレオチドに結合した反応試薬の有効モル濃度が大幅に増加し、DNAテンプレートを使用しない従来の有機反応に必要な濃度よりも数桁低い濃度でも水性環境中で目的の反応を起こすことができる。 ^[26] Liuらは、DNAテンプレートセットアップとシーケンスプログラム合成を使用して、64メンバーの化合物DNAエンコードマクロサイクルライブラリを生成した。^[27]

YoctoReactor (yR)は、DNA オリゴヌクレオチドの 3、4、または 5 方向のジャンクションへの自己組織化特性を利用して、ジャンクションの中心で小分子合成を誘導する 3D 近接駆動型アプローチです。図 5 は、4 方向 DNA ジャンクションの基本概念を示しています。

DNA 接合部の中心は、ヨクトリットル程度の容積を占めるため、YoctoReactor という名前が付けられています。この容積には、高 mM 範囲の反応濃度を生み出す単一分子反応が含まれます。DNA によって促進される有効濃度により、実際の濃度が数桁低い場合には起こらない化学反応が大幅に加速されます。

図 6 は、3 方向 DNA ジャンクションを使用した yR ライブラリの生成を示しています。

要約すると、化学ビルディング ブロック (BB) は、yR の各アームを表す 3 種類の二重特異性 DNA オリゴヌクレオチド (オリゴ BB) に、切断可能または切断不可能なリンカーを介して結合されます。組み合わせ方式での合成を容易にするために、オリゴ BB は、DNA に (a) オリゴの遠位端に結合した BB のコード (色付きの線) と (b) 一定した DNA 配列の領域 (黒の線) が含まれるように設計されており、これにより、DNA が自己組織化されて 3 方向ジャンクション (BB とは無関係) が形成され、その後化学反応が起こります。化学反応は段階的な手順で実行され、各ステップの後に DNA が連結され、生成物がポリアクリルアミド ゲル電気泳動によって精製されます。切断可能なリンカー (BB-DNA) は、1 つの位置を除くすべての位置で使用され、DNA コードへの単一の共有結合を持つ小分子のライブラリが生成されます。表 1 は、yR テクノロジを使用してさまざまなサイズのライブラリを生成する方法を示しています。

yR 設計アプローチは、(a) 反応物間の距離と (b) 反応部位の周囲の配列環境の両方に関して、不変の反応部位を提供します。さらに、単一のポットで組み合わせて混合されたオリゴ BB 部分のコードと BB 間の密接な接続により、ライブラリのエンコードに高い忠実性がもたらされます。さらに、合成された生成物のコードは事前に設定されておらず、むしろ組み合わせて組み立てられ、本来の生成物と同期して合成されます。

最近、ヨクトリアクター ライブラリ (yR) をスクリーニングするための均一な方法が開発されました。この方法では、油中水型エマルジョン技術を使用して、個々のリガンド-ターゲット複合体を分離します。バインダー トラップ エンリッチメント (BTE) と呼ばれるこの方法では、解離が支配的な速度でエマルジョン液滴に結合ペア (DNA 標識タンパク質ターゲットと yR リガンド) をトラップすることで、タンパク質ターゲットに対するリガンドが識別されます。トラップされると、ターゲットとリガンド DNA はライゲーションによって結合され、結合情報が保持されます。

今後、ヒットの識別は基本的にカウント作業になります。結合イベントに関する情報は、結合した DNA を配列し、カウントすることで解読されます。選択的結合は、ランダム結合よりもはるかに高い頻度でカウントされます。これは、ターゲットとリガンドのランダムな捕捉が、エマルジョン内の多数の水滴によって「希釈」されるため可能です。BTE の低ノイズおよびバックグラウンド信号特性は、ランダム信号の「希釈」、表面アーティファクトの欠如、および yR ライブラリとスクリーニング方法の高忠実度に起因します。スクリーニングは、シングル チューブ方式で実行されます。生物学的に活性なヒットは、偽陽性率が低いという特徴を持つ BTE の 1 ラウンドで識別されます。

BTE は、生体内のリガンド-ターゲット相互作用の非平衡特性を模倣し、結合複合体を捕捉するエマルジョンが動的解離段階で形成されるため、リガンド-ターゲット滞留時間に基づいてターゲット固有のリガンドをスクリーニングする独自の可能性を提供します。

DNA エンコードされた化学ライブラリからの選択に続いて、特定の結合化合物を迅速かつ効率的に識別するためのデコード戦略は、DEL技術のさらなる開発にとって重要です。これまで、サンガー シーケンスベースのデコード、マイクロアレイベースの方法論、およびハイスループット シーケンス技術が、DNA エンコードされたライブラリ選択のデコードの主な方法論でした。

多くの著者が暗黙のうちに伝統的なサンガー配列決定法に基づくデコードを想定したものですが^{[7] [8] [18] [23] [27]、}単純にライブラリの複雑さに応じて配列するコードの数は、伝統的なサンガー配列決定法では明らかに非現実的な作業です。しかし、DNAエンコードされた化学ライブラリをハイスループット方式でデコードするためのサンガー配列決定法の実装は、初めて説明されました。^[18]ライブラリ化合物のDNAタグの選択とPCR増幅の後、複数のコード配列を含むコンカタマーが生成され、ベクターに連結されました。結果として得られたコロニーの代表的な数をサンガー配列決定した後、選択前後のDNAエンコードされたライブラリサンプルに存在するコードの頻度が明らかになりました。^[18]

DNAマイクロアレイは、分子生物学や医学で広く使用されているハイスループット調査用のデバイスです。これは、特定の DNA 配列を含む数ピコモルのオリゴヌクレオチドを含む一連の微細スポット (「特徴」または「場所」) で構成されています。これは、適切な条件下でDNA またはRNAサンプルをハイブリダイズするためのプローブとして使用される遺伝子またはその他の DNA 要素の短いセクションです。プローブとターゲットのハイブリダイゼーションは通常、蛍光標識されたターゲットの蛍光ベースの検出によって検出および定量化され、ターゲット核酸配列の相対的な存在量が決定されます。マイクロアレイは、 ESAC DNA でエンコードされたライブラリ^[18]および PNA でエンコードされたライブラリ^[28]のデコードに成功しています。 ライブラリ内の個々の化合物を表すコーディングオリゴヌクレオチドは、BioChip Arrayer ロボットを使用してマイクロアレイスライド上にスポットされ、化学的に結合されます。次に、選択から分離された結合化合物のオリゴヌクレオチドタグを蛍光プライマーを使用してPCR増幅し、DNAマイクロアレイスライドにハイブリダイズします。その後、マイクロアレイはレーザースキャンを使用して分析され、スポット強度が検出され、定量化されます。選択前後のDNAマイクロアレイスライドのスポット強度を比較することで、優先結合化合物の濃縮が明らかになります。 ^[18]

DNAでエンコードされた化学ライブラリの複雑さ（通常10 ³～ 10 ⁶のメンバー）を考慮すると、従来のサンガーシーケンスベースのデコードは、シーケンスの1塩基あたりのコストが高く、手順も面倒なため、実際には使用できない可能性があります。^[29] ハイスループットシーケンス技術は、キャピラリー 電気泳動の使用を置き換えてシーケンスプロセスを並列化し、一度に数千または数百万のシーケンスを生成する戦略を活用しました。2008年には、もともとゲノムシーケンス用に開発されたハイスループットシーケンス技術（つまり「454テクノロジー」）が、4000の化合物を含むDNAでエンコードされた化学ライブラリの高速で効率的なデコードに初めて実装されたことが説明されました。^{[16]この研究により、}ストレプトアビジンに対してサブマイクロモルの解離定数を持つ新しい化合物が特定され、数百万の化合物を含むDNAエンコードライブラリを構築、選択、デコードできることが明確に示されました。^[16]

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