循環腫瘍細胞

循環腫瘍細胞（CTC ）は、原発性腫瘍から循環器系の血液またはリンパ器系のリンパ液に流出した癌細胞です。^[1] CTCは体内を運ばれ、他の臓器に運ばれ、そこで循環から外れて二次性腫瘍の成長の種となることがあります。^{[2] [1]これは}転移として知られており、癌関連死のほとんどの原因となっています。^[3]

CTCの検出と分析は、患者の早期予後を予測し、適切な治療法を決定するのに役立ちます。^[4]現在、 CTC検出にはFDA承認の方法が1つあり、乳がん、大腸がん、前立腺がんの診断に使用されています。^[5]

CTC の検出、つまり液体生検は、従来の組織生検に比べていくつかの利点があります。非侵襲的で、繰り返し使用でき、転移リスク、病気の進行、治療の有効性に関するより有用な情報を提供します。^{[6] [7]}たとえば、がん患者の血液サンプルを分析すると、病気が進行するにつれて CTC の検出が増加する傾向があることがわかりました。^[8]血液検査は簡単に安全に実行でき、時間の経過とともに複数のサンプルを採取できます。対照的に、固形腫瘍の分析には侵襲的な手順が必要であり、患者のコンプライアンスを制限する可能性があります。時間の経過とともに病気の進行を監視できれば、患者の治療法を適切に変更することができ、予後と生活の質が向上する可能性があります。病気の将来の進行を予測する能力の重要な側面は、繰り返しの CTC 数が少なく増加していない場合に手術の必要性が (少なくとも一時的に) なくなることです。手術を回避することの明らかな利点には、がん手術の生来の腫瘍形成性に関連するリスクを回避できることが含まれます。このため、転移性疾患の患者におけるCTCの検出に必要な感度と再現性を備えた技術が最近開発されました。^{[9] [10] [11] [12] [13] [ 14] [15 ] [16]}一方、CTCは非常に稀で、血液1ミリリットルあたり数個しか存在しないことが多く、検出が困難です。さらに、CTCは患者ごとに異なるさまざまなマーカーを発現することが多く、高い感度と特異性を備えた技術の開発が困難です。

癌腫（最も多くみられる上皮由来の癌）に由来するCTCは、上皮マーカーの発現、大きさ、アポトーシスの有無によって分類できる。一般的に、CTCはアノイキス耐性であり、基質に付着することなく血流中で生存できる。^[17]

1. 従来のCTCは、無傷で生存可能な核、上皮起源を示すEpCAMとサイトケラチンの発現、細胞が造血起源ではないことを示すCD45の欠如、そしてより大きなサイズ、不規則な形状または細胞内形態を特徴とする。^[18]
2. サイトケラチン陰性CTCは、EpCAMまたはサイトケラチンの欠如を特徴とし、これは未分化表現型（循環癌幹細胞）または間葉表現型の獲得（上皮間葉転換またはEMTとして知られる）を示している可能性がある。これらのCTC集団は、最も耐性があり、転移しやすい可能性がある。また、サイトケラチンもCD45も発現していないため、分離がより困難である。それ以外では、その形態、遺伝子発現、およびゲノミクスは他の癌細胞と同様である。^[19]
3. アポトーシスCTCは、アポトーシス（プログラム細胞死）を起こしている従来のCTCです。これらは、アポトーシスに関連する核の断片化や細胞質のブレブ形成を特定するEpic Sc​​iences法によって実験的に行われたように、治療反応をモニタリングするために使用できます。ベースラインから治療までの従来のCTCとアポトーシスCTCの比率を測定すると、がん細胞を標的にして殺す治療効果の手がかりが得られます。^[19]
4. 小型CTCはサイトケラチン陽性でCD45陰性ですが、大きさや形は白血球に似ています。重要なのは、小型CTCにはCTCであることを識別するがん特異的バイオマーカーがあることです。小型CTCは進行性疾患や小細胞癌への分化に関与しており、異なる治療法が必要になることが多いです。^[20]

循環腫瘍細胞は、ほとんどの場合、クラスターとして存在します。^[21] CTC クラスターは、2 つ以上の循環腫瘍細胞 (CTC) が結合した集合体です。これらのクラスターは、従来の CTC、小型 CTC、またはサイトケラチン陰性 CTC で構成され、循環内の他の細胞と区別する癌特異的バイオマーカーを持っています。研究では、CTC クラスターは転移の可能性が高く、予後が悪いことが示されています。たとえば、研究では、CTC が 1 つしかない前立腺癌患者は、CTC クラスターを持つ患者と比較して、平均生存率が 8 倍長いことが実証されています。同様の結果が大腸癌でも報告されています。^{[22] [23]}

循環腫瘍細胞クラスターには2つのタイプがあり、がん細胞のみで構成されるものはホモタイプと呼ばれます。白血球、線維芽細胞、内皮細胞、血小板などの他の細胞も組み込まれたCTCクラスターはヘテロタイプと呼ばれます。[ 24 ^{]ヘテロタイプクラスターは}微小塞栓としても知られています。これらの微小塞栓は転移の可能性を高める可能性があることが示唆されています。^[21]

がん脱出仮説は、CTC クラスターは、これまで想定されていたように単一細胞に分離するのではなく、転移プロセス全体を通じてそのまま残ることを示唆している。この仮説によると、クラスターは血流に入り、凝集体として移動し、離れた転移部位でばらばらにならずに循環から出る。これにより、クラスターは多細胞性を維持し、転移効率を高めることができる。この仮説は、クラスター内の細胞間サポートによってもたらされる生存上の利点が、単一の CTC と比較して転移の可能性を高めると仮定している。^{[22] [24]}

CTCクラスターは、特定の癌治療に対する耐性を付与する明確な遺伝子発現プロファイルを示し、個々の腫瘍細胞よりも耐性が強い。転移中も多細胞性であり続ける能力が、その優れた生存率と転移能を説明しているのかもしれない。^[25]

CTCクラスターと転移におけるその役割に関する研究は進化を続けており、がんの脱出仮説は、これらのクラスターががんの進行にどのように寄与するかについての新たな視点を提供しています。CTCクラスターを検出して分析することで、重要な予後情報が得られ、がん患者の治療決定に役立つ可能性があります。^[26]

CTCの検出は予後や治療に重要な意味を持つ可能性があるが、その数は非常に少ないため、これらの細胞は簡単には検出されない。^[27]原発腫瘍から剥離した細胞のうち、転移を形成できるのはわずか0.01％と推定されている。^[28]

転移性疾患の患者では、循環腫瘍細胞が全血1mLあたり1～10個のCTCという頻度で見つかります。^[29] 比較すると、血液1mLには数百万個の白血球と10億個の赤血球が含まれています。この低頻度は、癌細胞の特定の困難さと関連しており、CTCの生物学的特性を理解するための重要な要素として、濃縮によって血液1mLあたり1個のCTCを分離できる技術とアプローチが必要であることを意味します。または、さらに良いのは、さまざまな種類の癌の患者の診断病理学画像量の要件を満たすのに十分な高解像度ですべてのCTCサブタイプを識別する濃縮なしのアッセイです。^[19]現在までに、CTCはいくつかの上皮癌（乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌）で検出されており^{[30] [31] [32] [33]}、臨床的証拠は転移性病変の患者でCTCが分離される可能性が高いことを示しています。

CTCは通常（2011年現在）、特定の腫瘍マーカー（通常はEpCAM ）を認識できる特異的抗体を使用して血管から捕捉されます。しかし、このアプローチは、濃縮ステップに必要なイベントである細胞表面上の選択されたタンパク質の十分な発現の必要性によって偏っています。さらに、EpCAMやその他のタンパク質（例：サイトケラチン）は一部の腫瘍では発現せず、上皮間葉転換（ EMT ）中にダウンレギュレーションされる可能性があるため、新しい濃縮戦略が必要です。^[34]

最初の証拠は、人間の医療に適用されるCTCマーカーが他の種でも保存されていることを示しています。CK19を含むより一般的なマーカーのうち5つは、悪性乳腺腫瘍のある犬の血液中のCTCを検出するのにも役立ちます。^{[35] [36]} IsofFuxやMaintracなどの新しいアプローチでは、7.5mlの血液からより多くの細胞を識別できます。^{[37] [38]非常にまれなケースでは、CTCが通常の}血液塗抹標本検査で確認できるほど大量に存在します。これは癌性白血病または癌細胞白血病と呼ばれ、予後不良に関連しています。^[39]

現在までに、CTCを分離して計数するためのさまざまな研究方法が開発されている。^[40]米国食品医薬品局（FDA）が承認した全血中のCTCの計数方法は、CellSearchシステムのみである。^[41]この方法を使用して行われた広範な臨床試験では、CTCの存在が転移性乳がん、大腸がん、または前立腺がんの患者の全生存率の強力な予後因子であることがわかっている。 ^{[8] [42] [43] [44] [45] [46] [47]}

CTC は転移の生物学を理解する上で極めて重要であり、腫瘍の進行と治療への反応を非侵襲的に評価するためのバイオマーカーとしての可能性を期待されています。しかし、CTC は循環血液中の全細胞のうちのごくわずかな数を占め、全血 1 mL あたり CTC は数百万個の白血球と 10 億個の赤血球と比較して 1～10 個であるため、CTC の分離と特性評価は大きな技術的課題となっています。^[48]そのため、CTC 研究者にとっての主な課題は、CTC の分子特性評価を可能にする CTC 精製の一般的な難しさです。末梢血中の CTC を分離するためのいくつかの方法が開発されており、基本的に生物学的方法と物理的方法、および両方の戦略を組み合わせたハイブリッド方法の 2 つのカテゴリに分類されます。技術は、分離のために CTC を選択するか (正の選択)、すべての血液細胞を除外するか (負の選択) に基づいて分類することもできます。

生物学的方法は、特異性の高い抗原結合に基づいて細胞を分離し、最も一般的にはモノクローナル抗体による陽性選択が行われる。EpCAM 、HER2、PSAなどの腫瘍特異的バイオマーカーに対する抗体が使用されている。最も一般的な技術は、CellSearchやMACSで使用される磁性ナノ粒子ベースの分離（免疫磁気アッセイ）である。研究中の他の技術には、マイクロ流体分離^[49]や、免疫磁気アッセイとマイクロ流体分離の組み合わせがある。^{[50] [51] [52] [53]}微細加工技術の発達に伴い、磁場をより適切に制御し、CTCの検出を支援するために、マイクロスケールの磁気構造が実装されている。^{[54] [55] [56]}ワクシニアウイルスなどの腫瘍溶解性ウイルス^[57]は、CTCを検出および識別するために開発されている。抗体の代わりに、CTCの表面にある癌胎児性コンドロイチン硫酸に結合するマラリアVAR2CSAタンパク質などの人工タンパク質を使用する代替方法も存在する。 ^[58] CTCは、GILUPI GmbHによって開発された改良セルジンガー法によって血液から直接回収することもできます。 ^{[59] [60]}抗体でコーティングされた金属ワイヤを末梢静脈に挿入し、一定時間（30分）そこに留まります。この間、血液中のCTCは抗体（現在は抗EpCAM）と結合することができます。インキュベーション時間後、ワイヤを取り外して洗浄し、患者の血液から分離された天然CTCをさらに分析することができます。分子遺伝学、免疫蛍光染色、およびその他のいくつかの方法が利用可能です。^{[61] [62]}この方法の利点は、CTCを分析できる血液量が多いことです（30分で約750 ml、採血サンプル7.5 mlと比較して）。

CellSearch は、 CTC 分離用の FDA 承認プラットフォームとして唯一です。この方法は、ビオチン類似体を運ぶポリマー層でコーティングされ、EpCAM に対する抗体と結合した鉄ナノ粒子を使用してCTC を捕捉します。分離は分析装置と連動しており、特定の蛍光抗体結合体で染色した分離細胞の画像を撮影します。血液は防腐剤を加えたEDTAチューブに採取します。研究室に到着すると、7.5 mL の血液が遠心分離され、調製システムに入れられます。このシステムは、まず、強磁性流体ナノ粒子と磁石を使用して腫瘍細胞を免疫磁気的に濃縮します。次に、回収した細胞を透過処理し、核染色、CD45 (白血球マーカー) およびサイトケラチン 8、18、19 (上皮マーカー)に対する蛍光抗体結合体で染色します。次に、サンプルは分析装置でスキャンされ、核、サイトケラチン、CD45染色の画像が撮影されます。^[63] CTCと見なされるには、細胞は核を含み、細胞質のサイトケラチン発現が陽性で、CD45マーカー発現が陰性であり、直径が5μmより大きい必要があります。上記の基準を満たす腫瘍細胞の総数が5個以上であれば、血液サンプルは陽性です。前立腺がん、乳がん、結腸がんの患者を対象に行われた研究では、陽性サンプルを持つ転移性患者の生存期間の中央値は、陰性サンプルを持つ転移性患者の生存期間の中央値の約半分でした。このシステムは、回収能力が93％で、全血7.5mLあたり1つのCTCの検出限界が特徴的です。特定のがん種については、IsoFluxなどの代替方法がより高い感度を示しています。^[64]

この自動化された方法では、サイズ濾過を使用して、他の血液成分からより大きく圧縮性の低い循環腫瘍細胞を濃縮します。Parsortix システムは、1 mL から 40 mL の血液サンプルを取り込むことができます。6.5 ミクロンのギャップを備えた使い捨てのマイクロ流体カセットは、赤血球と白血球の大部分を通過させますが、循環腫瘍細胞や胎児細胞などのより大きく希少な細胞は捕捉されます。捕捉された細胞は、識別のために抗体で自動的に染色するか、カセットから放出してその後の分析を行うことができます。これらの放出/収集された細胞は生きており、下流の細胞および分子技術で分析できるほか、培養することもできます。濾過カセットは、さまざまな種類のがん細胞を捕捉します。2022 年 5 月、Parsortix PC1 システムは、転移性乳がん患者の血液から循環腫瘍細胞 (CTC) を捕捉して収集し、その後の分析を行う医療機器として FDA の承認を受けました。 IVD アプリケーションに加えて、PC1 は MBC-01 転移性乳がんキットと併用して、臨床検査室で作成および検証された研究調査やラボ開発テスト (LDT) に使用することもできます。

この方法には、核のない赤血球から有核細胞を分離する技術が関係しています。正常な白血球や CTC を含むすべての有核細胞は、がんバイオマーカーに特異的な蛍光タグ付き抗体にさらされます。さらに、Epic の画像化システムは、スライド上のすべての細胞 (約 300 万個) の写真を撮影し、各細胞の正確な座標を記録し、4 つの蛍光マーカーの蛍光強度や 86 の異なる形態学的パラメータなど、90 の異なるパラメータについて各細胞を分析します。Epic は、FISHやその他の染色技術を使用して、重複、欠失、再配置などの異常を探すこともできます。この画像化および分析技術により、スライド上のすべての細胞の座標を知ることができるため、スライドから 1 つの細胞を取り出し、次世代シーケンシングを使用して分析することができます。血液病理学で訓練されたアルゴリズムには、多数の形態学的測定と、サイトケラチンおよび CD45 の発現が組み込まれています。次にアルゴリズムは候補となるCTCを提案し、訓練を受けた読者がそれを確認します。関心のある細胞は関連する表現型および遺伝子型マーカーについて分析され、局所の白血球がネガティブコントロールとして含まれます。^[65] Epicの分子アッセイはタンパク質発現を測定し、20種類以上の癌のCTCにおけるゲノム異常も調べます。

Maintrac は、体液中の希少細胞とその分子特性を識別するために顕微鏡的in vitro診断法を応用した診断血液検査プラットフォームです。これは、EpCAM 特異的抗体を使用した陽性選択に基づいています。 ^[66] Maintrac は、循環腫瘍細胞の顕微鏡的識別に基づくアプローチを使用します。プロセス中の細胞の損傷と損失を防ぐために、Maintrac は識別に向けて 2 つのステップのみを使用します。他の多くの方法とは対照的に、maintrac は細胞を精製または濃縮せず、他の血液化合物のコンテキスト内で細胞を識別します。生きた細胞を取得し、それらの細胞のストレスを軽減するために、血液細胞は 1 つの遠心分離ステップと赤血球溶解によって準備されます。CellSearch と同様に、maintrac は EpCAM 抗体を使用します。ただし、濃縮には使用されず、それらの細胞を識別するための蛍光マーカーとして使用されます。ヨウ化プロピジウムによる核染色と組み合わせると、maintrac 法は死細胞と生細胞を区別できます。生きたプロピジウムを除いた EpCAM 陽性細胞のみが潜在的な腫瘍細胞としてカウントされます。腫瘍に成長できるのは生きた細胞だけなので、死にかけているEpCAM陽性細胞は害を及ぼすことはない。懸濁液は蛍光顕微鏡で分析され、自動的にイベントをカウントする。同時イベントギャラリーは、ソフトウェアが真の生きた細胞を見つけたかどうかを確認し、たとえば皮膚上皮細胞を区別するために記録される。この方法を厳密に検証したところ、サイトケラチンまたはCD45の追加の抗体には利点がないことがわかった。^{[38] [67]}

メイントラックは他の方法とは異なり、単一細胞数を予後マーカーとして使用せず、細胞数の動態を利用します。腫瘍細胞数の増加は、腫瘍の活動が継続していることを示す重要な要素です。^[68]細胞数の減少は治療が成功した兆候です。したがって、メイントラックは化学療法の成功を確認するために使用でき^{[38] [69]}、ホルモン療法または維持療法中の治療を監視するために使用できます^{[70] [71]} メイントラックは、癌の再発をモニターするために実験的に使用されています。^{[72] [73]}メイントラックを使用した研究では、癌のない患者の血液中にEpCAM陽性細胞が見つかることが示されています。^[74]クローン病などの炎症性疾患でも、EpCAM陽性細胞のレベルが上昇しています。重度の皮膚火傷を負った患者も、血液中にEpCAM陽性細胞を持っている可能性があります。したがって、早期診断のツールとしてEpCAM陽性細胞を使用することは最適ではありません。

物理的方法はフィルターベースであることが多く、特定のエピトープではなくサイズによってCTCを捕捉することができます。^[16] ScreenCellは、数分でヒト全血からCTCを高感度かつ特異的に分離できる濾過ベースの装置です。^[75] 末梢血を採取し、ScreenCell分離装置で4時間以内に処理してCTCを捕捉します。捕捉された細胞は、細胞培養またはViewRNA in situハイブリダイゼーションアッセイを使用した直接的な特性評価にすぐに使用できます。Parsortix法は、サイズと変形可能性に基づいてCTCを分離します。^[76]

ハイブリッド法は、物理的分離（勾配、磁場などによる）と抗体による細胞回収を組み合わせたものです。その一例は、感度の高い二重勾配遠心分離と磁気細胞選別検出および計数法で、乳がん患者の循環上皮がん細胞をネガティブ選択で検出するために使用されています。^[77]ネガティブ選択の原理は、抗体パネルとフィコールによる従来の勾配遠心分離を使用してすべての血液細胞を回収することに基づいています。ISETテストとして知られる同様の方法は、循環前立腺がん細胞の検出に使用されており^{[78] [79] [80]}、RosetteStepとして知られる別の技術は、小細胞肺がん患者からCTCを分離するために使用されています。^{[81]同様に、マサチューセッツ総合病院の研究者は、}マイクロ流体デバイス上での慣性フォーカスを使用するネガティブ選択法を開発しました。 CTC-iChipと呼ばれるこの技術は、まず赤血球などCTCとしては小さすぎる細胞を除去し、次に磁性粒子を使って白血球を除去する。^[82]

一部の薬剤は、特定の要件を満たす癌に対して特に効果的です。たとえば、ハーセプチンはHer2陽性患者には非常に効果的ですが、Her2 陰性患者にはあまり効果がありません。原発腫瘍が除去されると、従来の組織タイピングによる癌の現在の状態の生検は不可能になります。^[83]多くの場合、何年も前に除去された原発腫瘍の組織切片がタイピングに使用されます。CTC のさらなる特徴付けは、現在の腫瘍表現型の決定に役立つ可能性があります。CTC に対して FISH アッセイが行われており、免疫蛍光法を使用してIGF-1R、Her2、Bcl-2、ERG、PTEN、ARの状態が決定されています。^{[7] [84] [85] [86] [87]}血液から分離された CTC では、単一細胞レベルの qPCR も実行できます。^[要出典]

患者由来CTCの臓器向性はマウスモデルで調査されている。^[88]乳がん患者から分離され、in vitroで増殖されたCTCは、マウスで骨、肺、卵巣、脳転移を生成できることが示され、対応する患者に見られる二次病変を部分的に反映している。驚くべきことに、患者の脳転移が現れるずっと前に分離された1つのCTC株は、マウスで脳転移を生成する能力が非常に高かった。これは脳転移の最初の予測例であり、CTCの転移前駆細胞の固有の分子特性が転移のメカニズムに関する新しい洞察を提供できるという概念実証であった。

形態学的外観は人間の検査員によって判断されるため、検査員間で大きなばらつきがあります。^[89] CTCの識別に形態学的外観を使用するCTCの計数方法はいくつかありますが、異なる形態学的基準を適用することもあります。最近の前立腺がんの研究では、患者と正常ドナーで見つかった細胞の絶対数は異なる形態学的定義間で10年以上も異なっているにもかかわらず、循環腫瘍細胞の多くの異なる形態学的定義は同様の予後価値を持つことが示されました。^[90]

CTC は 1869 年にトーマス・アシュワースによって転移性癌の男性の血液中に初めて観察され、彼は「癌そのものの細胞と同一の細胞が血液中に見られることは、同一人物に存在する複数の腫瘍の発生様式にいくらかの光を投げかける傾向がある」と仮定した。循環細胞の形態をさまざまな病変の腫瘍細胞と徹底的に比較した結果、アシュワースは「1 つ確かなことは、それら [CTC] が既存の癌組織から来たものであるならば、健常脚の内伏在静脈に到達するまでに循環系の大部分を通過したに違いない」という結論に至った。^[91]

現代の癌研究におけるCTCの重要性は、1990年代半ばに、CTCが病気の進行初期に存在することが実証されたことから始まりました。^[92] これらの結果は、ポール・リベルティが発明した強磁性流体（コロイド磁性ナノ粒子）と高勾配磁気分離器を使用した非常に感度の高い磁気分離技術によって可能になりました。この技術は、リベルティとレオン・テルスタッペンによる理論計算に基づいており、非常に小さな腫瘍が1日あたり1.0％未満の細胞を放出すると、血液中に検出可能な細胞が生成されるはずであると示しました。^[93]それ以来、さまざまな他の技術がCTCの計数と識別に応用されてきました。

現代の癌研究では、CTCは原発腫瘍のクローンから派生することが実証されており、アシュワースの発言を裏付けています。^{[94] CTCの生物学的特性を理解するために多大な努力が払われた結果、循環腫瘍細胞が}癌 の転移拡散において重要な役割を果たしていることが明らかになりました。^[95]さらに、高感度の単一細胞分析により、単一細胞レベルでタンパク質発現とタンパク質局在の両方に高いレベルの異質性が見られ、 ^[96] CTCは原発性生検と転移部位に見られる変化の両方を反映していました。^[97]