治療的遺伝子調節

治療的遺伝子調節とは、何らかの病気を緩和する目的で、さまざまな段階の 1 つで遺伝子の発現を変更する行為を指します。遺伝子調節は内因性遺伝子の発現を変更しようとする (おそらく新しい調節タンパク質をコードする遺伝子の導入を通じて) のに対し、遺伝子治療は、その産物が受信者に直接役立つ遺伝子の導入に関係する点で、遺伝子治療とは異なります。

遺伝子発現の調節は、DNA結合剤（人工転写因子の場合もある）、小分子、または合成オリゴヌクレオチドによって転写レベルで媒介される。また、RNA干渉によって転写後に媒介されることもある。

治療的調節へのアプローチでは、 gDNAレベルで遺伝子を特に標的として内因性転写を調節する薬剤を使用します。mRNA またはタンパク質レベルでの調節と比較したこのアプローチの利点は、すべての細胞に gDNA のコピーが 1 つしか含まれていないことです。したがって、標的のコピー数が大幅に少なくなり、理論的には薬剤をはるかに低い用量で投与できます。^{[引用が必要]}

このアプローチは、従来の遺伝子治療に比べていくつかの利点も提供します。内因性転写を直接標的とすることで、スプライスバリアントの正確な相対的発現が得られるはずです。対照的に、従来の遺伝子治療では通常、化学量論的に発現するスプライス転写バリアントのセットではなく、1つの転写のみを発現できる遺伝子が導入されます。さらに、ウイルスによって導入された遺伝子は、メチル化による遺伝子サイレンシングの標的となり、従来の遺伝子治療の効果を打ち消すことができます。^[1]これは、内因性DNAに作用するため、転写調節にとって問題になるとは予想されません。

転写遺伝子調節因子として作用する薬剤には、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）、合成ポリアミド（SPA）、DNA結合タンパク質の3つの主要なカテゴリーがあります。^[2]

三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）は、治療的遺伝子調節を達成するための潜在的な方法の1つです。TFOは約10〜40塩基対の長さで、二本鎖DNAの主溝に結合して3本目の鎖または三重らせんを形成します。^{[2] [3]結合は、すでに}ワトソン・クリックらせんの形になっている二本鎖DNA上のプリン（A / G）塩基へのフーグスティーン水素結合を介して、ポリプリンまたはポリピリミジン領域で起こります。^[4]

TFO はポリプリンまたはポリピリミジン分子のいずれかであり、二重らせんの 2 つの鎖の 1 つに平行または反平行の向きで結合して、ポリプリンまたはポリピリミジン領域を標的とします。DNA 認識コードは TFO 結合の平行および反平行様式で異なるため、ピリミジン(C / T) で構成される TFO は、フーグスティーン水素結合を介して標的二重らせんのプリンに富む鎖に平行様式で結合します。^[3]プリン(A / G) または混合プリンとピリミジンで構成される TFO は、逆フーグスティーン結合を介して同じプリンに富む鎖に反平行様式で結合します。TFO は二重鎖 DNA のプリンに富む標的鎖を認識できます。^[2]

TFOモチーフが平行に結合して水素結合を形成するためには、シトシン残基の位置3の窒素原子がプロトン化されている必要があるが、生理的pHレベルではプロトン化されていないため、平行結合が妨げられる可能性がある。^[2]

もう一つの制限は、TFO はプリンを多く含む標的鎖にしか結合できないため、内因性遺伝子標的部位の選択肢が二重鎖 DNA のポリプリン-ポリピリミジン領域に限定されることです。TFO がピリミジン塩基にも結合できるようにする方法が開発されれば、TFO はゲノムのどの部分でも標的とすることができます。また、ヒトゲノムにはポリプリンおよびポリピリミジン配列が豊富に含まれており、 TFO が標的 DNA 領域に結合する特異性に影響を与える可能性があります。この制限を克服するアプローチは、特定の標的配列に対する TFO の親和性を高めるためにロックされた核酸として機能する修飾ヌクレオチドを含む TFO を開発することです。^[5]

その他の制限としては、結合親和性と特異性、生体内安定性、細胞への取り込みに関する懸念などがある。研究者らは、TFOとDNA二重鎖間の静電反発を減らすためにTFO骨格を改変するなど、化学修飾によってTFOの特性を改善することで、これらの制限を克服しようとしている。また、分子量が大きいため、細胞への取り込みは限られており、これを克服するための戦略には、 DNA凝縮剤、コレステロールなどの疎水性残基へのTFOの結合、または細胞透過性向上剤などがある。^[2]

科学者たちは、TFOを治療製品に変える技術を今も改良中で、その多くは抗原療法における潜在的な応用を中心に展開しています。特に、TFOは部位特異的変異の誘発剤、標的DNAを選択的かつ特異的に切断する試薬、および遺伝子発現の調節剤として使用されています。^[6]こうした遺伝子配列改変法の1つは、TFOでDNAを標的にして標的遺伝子を活性化する方法です。標的配列が遺伝子の2つの不活性コピーの間にある場合、TFOなどのDNAリガンドは標的部位に結合し、DNA損傷として認識されます。これらの損傷を修復するために、DNA修復複合体が標的配列上に組み立てられ、DNAが修復されます。切断が十分に進んで切断部位の両側に互換性のある末端が生成され、3'オーバーハングが連結されて遺伝子の単一の活性コピーが形成され、遺伝子の2つのコピー間のすべての配列が失われると、分子内組換え基質の損傷は修復され、検出される。^[4]

モデルシステムでは、TFOはDNAレベルで遺伝子発現を阻害するだけでなく、モデル内で標的変異を誘発することができます。^[6] TFOによる内因性標的の転写伸長阻害は、細胞培養でテストされ、成功しています。^[7]しかし、in vitroでの多くの成功にもかかわらず、標的へのアクセス性の問題により、細胞への応用では成果が限られています。

TFO は、転写の開始または伸長を標的にしたり、三重鎖結合部位で停止させたり、細胞固有の修復経路を刺激して標的配列に永続的な変化を導入したりすることで、サイレンシング遺伝子をサイレンシングする可能性があります。これらのアプリケーションは、DNA レベルで遺伝子発現を阻害する癌治療法の開発に関連している可能性があります。異常な遺伝子発現は癌の特徴であるため、これらの内因性遺伝子の発現レベルを調節することは、複数の癌タイプの治療法として機能する可能性があります。

合成ポリアミドは、DNA の副溝に特定の水素結合を形成する小さな分子のセットです。遺伝子の調節領域または転写領域に結合して転写を変更することで直接効果を発揮したり、DNA ターゲット サイトの周囲に変化をもたらす別の物質と意図的に結合することで間接的に効果を発揮したりします。

DNAの副溝にある特定の塩基は、小さな合成ポリアミド（SPA）によって認識され、結合することができます。DNA結合SPAは、ヒドロキシピロール（Hp）、イミダゾール（Im）、およびピロール（Py）の3つのポリアミドアミノ酸成分を含むように設計されています。 ^[10]これらのアミノ酸の鎖は、ヘアピン構造でループします。ヘアピンの両側のアミノ酸は、ワトソン-クリック塩基対の両側を特異的に認識できるペアを形成します。これは、DNAの副溝内の水素結合によって発生します。アミドペアPy/Im、Py/Hp、Hp/Py、およびIm/Pyは、それぞれワトソン-クリック塩基対CG、AT、TA、およびGCを認識します（表1）。SPAによる5'-GTAC-3'の認識のグラフ表示については、図を参照してください。SPAは毒性が低いですが、ヒトの遺伝子調節にはまだ使用されていません。

遺伝子調節剤としての未改変SPAの主な構造上の欠点は、認識配列を5ワトソン・クリック塩基対を超えて拡張できないことである。DNA副溝の自然な湾曲は、ヘアピン構造が適合するには曲がりがきつすぎる。この問題の回避策を提案しているグループがいくつかある。^{[8] [11] [12] [13] [14]構造を緩和する}ベータアラニンを挿入することにより、SPAが副溝の湾曲にうまく沿うようにすることができる。^[10]認識長を拡張する別の方法は、いくつかの短いヘアピンを連続して使用することである。^{[15] [16]}この方法により、認識長が最大11ワトソン・クリック塩基対まで増加した。

SPA は、標的遺伝子の転写領域内で結合することにより転写を阻害する可能性があります。この阻害は、RNA ポリメラーゼによる伸長をブロックすることにより発生します。

SPA は転写調節因子結合部位を標的として転写を調節することもあります。調節因子が転写の活性化因子である場合、転写レベルが低下します。例として、活性化転写因子 TFIIIA の結合部位を標的とする SPA は、下流の 5S RNA の転写を阻害することが実証されています。^[17]対照的に、調節因子が抑制因子である場合、転写レベルが増加します。例として、ヒト免疫不全ウイルス (HIV) タイプ 1 の長末端反復配列 (LTR) の発現を抑制する宿主因子 LSF を標的とする SPA は、LSF の結合をブロックし、その結果 LTR の発現を抑制解除します^[18] 。

SPA が DNA を直接修飾したり、他の因子やプロセスを直接ブロックする以外の作用を持つことは示されていません。ただし、修飾剤はヘアピン構造の末端に結合することができます。SPA が DNA に特異的に結合することで、結合した修飾剤を部位特異的に標的とすることができます。

SPAは、SV40 DNAを損傷し架橋することができるDNAアルキル化部分シクロプロピルピロロインドール^[19]およびクロラムブシル^[20]と対になっていました。この効果は細胞周期と成長を阻害しました。化学療法剤であるクロラムブシルは、SPAと結合した場合、結合しない場合よりも効果的でした。

2012年、SPAは強力なヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤であるSAHAと結合しました。^[21] SAHAが結合したSPAはOct-3/4とNanogを標的とし、エピジェネティックなリモデリングを誘導し、その結果、マウス胎児線維芽細胞における複数の多能性関連遺伝子の発現を増加させました。

デザイナージンクフィンガータンパク質は、DNAの特定の領域を標的とするために使用される人工タンパク質です。これらのタンパク質は、天然のジンクフィンガードメインのDNA 結合能力を利用して、ゲノムの特定の標的領域を調節します。^[22]デザイナージンクフィンガーモチーフと天然ジンクフィンガーモチーフの両方で、タンパク質は2つのβシートと1つのαヘリックスで構成されています。αヘリックスの2つのヒスチジン残基とβシートの2つのシステイン残基は亜鉛原子に結合しており、タンパク質ドメイン全体を安定化させる役割を果たしています。この安定化は、DNA認識および結合ドメインとして機能するαヘリックスに特に有益です。転写因子TFIIIAは、ジンクフィンガーモチーフを持つ天然タンパク質の例です。^[23]

ジンクフィンガーモチーフはらせん状DNAの主溝に結合し^[23] 、 αヘリックス上のアミノ酸残基配列がモチーフに標的配列特異性を付与する。このドメインはDNAの7ヌクレオチド配列（DNAの主鎖上の位置1から6 、および相補鎖上の位置0と3 ）に結合し、それによってタンパク質モチーフが標的に対して高度に選択的であることを保証する。^{[22]デザイナージンクフィンガータンパク質を設計する際に、研究者は}部位特異的変異誘発の後に結合能力のランダム化試験を行うなどの技術を利用することができる^{[22] [24]}か、標的特異性がわかっているモチーフのin vitro組換えにより配列特異的な最終タンパク質のライブラリーを作成することができる^[25]

デザイナージンクフィンガータンパク質は、さまざまな方法でゲノム発現を調節することができます。最終的には、発現の結果に主に影響を及ぼす要因は 2 つあります。標的配列が DNA の調節領域かコーディング領域か、そしてジンクフィンガードメインにエフェクタードメインが結合しているかどうか、また結合している場合はその種類です。人工デザイナータンパク質の標的配列が調節ドメイン (複製のプロモーターやリプレッサーなど) である場合、天然の転写因子の結合部位が不明瞭になり、関連する遺伝子の転写がそれぞれ減少または増加します。^[26]同様に、標的配列がエクソンである場合、デザイナージンクフィンガーはRNA ポリメラーゼ転写複合体から配列を不明瞭にし、結果として遺伝子産物が切断されるか、または機能しなくなります。^[22]

ジンクフィンガーに結合したエフェクタードメインも同様の効果を持つ可能性があります。治療用遺伝子調節のためのデザイナージンクフィンガータンパク質の使用に関して最も重要なのは、これらのエフェクタードメインの機能です。メチラーゼドメインがデザイナージンクフィンガータンパク質に結合している場合、ジンクフィンガータンパク質が標的 DNA 配列に結合すると、その領域のDNA のメチル化状態が増加します。このように影響を受ける遺伝子の転写率は低下します。^[27]エフェクタードメインの多くは、DNAを直接的に（例えば、メチル化、切断、^[28]または標的DNA配列の組み換え^[29]を介して）調節するか、または転写速度を調節することによって（例えば、転写装置をブロックするリプレッサードメインを介して転写を阻害する、^[30]転写装置をその部位にリクルートする活性化ドメインによって転写を促進する、^[31]またはヒストンまたはその他のエピジェネティック修飾ドメインによってクロマチン状態および転写装置が影響を受ける遺伝子にアクセスする能力に影響を与える）調節する働きをする。^{[32]エピジェネティック修飾は、遺伝子のさまざまな発現レベルを決定する上での主要なテーマであり、局所レベルのヒストンから}染色体レベルのクロマチンまでDNA鎖がどれだけきつく巻かれているかが、DNA配列の転写装置へのアクセスに影響し、それによって転写速度に影響を与えるという考えによって説明される。^[23]上述のようにDNA鎖に直接影響を与えるのではなく、デザイナージンクフィンガータンパク質が標的DNA領域のエピジェネティック修飾状態に影響を及ぼす場合、遺伝子発現の調節も同様に達成できる可能性がある。

生体内で遺伝子発現を調節するためにデザイナージンクフィンガータンパク質を使用することに成功した最初の事例として、Chooら^{[26] は、}BCR-ABL 融合 癌遺伝子の特定の配列を標的とする 3 つのジンクフィンガードメインからなるタンパク質を設計しました 。この特定の癌遺伝子は、急性リンパ性白血病に関係しています。この癌遺伝子は、通常、癌の特徴である特定の成長因子がなくても白血病細胞を増殖させます。Chooらは、核内のゲノム DNA へのタンパク質の結合を促進するために、3 ドメインジンクフィンガータンパク質に核局在化シグナルを含めることにより、彼らが設計したタンパク質が生体内で癌遺伝子の転写を阻害できることを実証することができました。白血病細胞は通常の成長因子に依存するようになり、細胞周期が再び正常な調節の制御下に戻りました^[26]。

転写後遺伝子調節の主なアプローチは、RNA干渉（RNAi）によるものです。遺伝子調節にRNAiを使用する際の主な問題は、標的細胞への薬物送達です。^{[33] [34]} RNAi遺伝子調節は、炎症性腸疾患のマウスモデルの治療にマウスに適用され、成功しています。^[35]この治療では、短い干渉RNA（siRNA）を捕捉したリポソームベースのβ7インテグリン標的安定化ナノ粒子を使用しました。RNAi送達には、ポリプレックス送達、リガンド-siRNAコンジュゲート、ネイキッド送達、金ナノ粒子を使用した無機粒子送達、部位特異的局所送達など、いくつかの他の形式があります。^[36]

一方、デザイナージンクフィンガータンパク質は、臨床の場でいくつかの試験を受けています。臨床試験では、人工ジンクフィンガー転写因子であるEW-A-401の、心血管疾患である跛行の治療薬としての有効性と安全性が調査されています。[37] このタンパク質は、患者に人工転写因子の生成を促す人工プラスミドDNAで構成されており、その標的は血管の発達に^プラスの影響を与える血管内皮増殖因子A（VEGF-A）遺伝子です。米国食品医薬品局（FDA）による承認はまだ受けていませんが、このジンクフィンガータンパク質がヒトの末梢動脈疾患の治療に有望で安全な潜在的治療薬であることを確認する第1相臨床試験が2件完了しています。^[38]

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