人工転写因子

人工転写因子（ATF）は、遺伝子転写を活性化または抑制する、設計された単独または複数分子の転写因子です（生物学）。^[1]

ATF には、 DNA 結合ドメインと調節ドメイン（エフェクタードメインまたは調節ドメインとも呼ばれる）という2 つの主要コンポーネントが結合して含まれることがよくあります。 ^[1] DNA 結合ドメインは、特定の DNA 配列を高い親和性で標的とし、調節ドメインは結合した遺伝子を活性化または抑制する役割を担います。^[1] ATF は、遺伝子発現を直接制御したり、タンパク質やその他の転写因子をリクルートして転写を開始したり、タンパク質やその他の転写因子をリクルートして DNA を圧縮してRNA ポリメラーゼがDNA に結合して転写するのを阻害したりすることができます。遺伝子発現をアップレギュレーションする転写因子の例を図 1 の左側に示します。^{[1] [2]} ATF は DNA 結合ドメインと調節ドメインという 2 つの分離可能なコンポーネントで構成されているため、2 つのドメインは互換性があり、既存の天然転写因子から新しい ATF を設計できます。^[1]

ATFの応用としては、細胞状態の再プログラミング、癌治療、アンジェルマン症候群の治療法などが挙げられます。^{[2] [3] [4]}

DNA 結合ドメインは、ATF を特定の遺伝子配列に誘導します。天然の DNA 結合タンパク質は、DNA ターゲット配列に対する親和性が高いため、一般的に使用されていますが、現在、タンパク質のアミノ酸配列を相補的な DNA 結合配列に一致させるアルゴリズムは存在せず、新しい DNA 結合タンパク質の合理的な設計が制限されています。^[1]非ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびポリアミド DNA 結合ドメインが最近研究され、合理的な設計が可能になりました。^[1]選択される DNA 結合ドメインの種類は、ATF の目的の用途によって異なります。一般的な DNA 結合ドメインについては、以下の「ATF DNA 結合ドメインの種類」セクションを参照してください。^{[1] [2]}

調節ドメインは結合した遺伝子を活性化または抑制する役割を担っており、遺伝子発現を直接制御するか、他のタンパク質や転写因子をリクルートして転写レベルを変化させることでこの制御を実現します。^{[1] [2]}遺伝子をアップレギュレーションする1つの方法は、ATFがヒストンを包むDNAを緩めるタンパク質をリクルートしてRNAポリメラーゼが遺伝子に結合して転写できるようにすることです。同様に、DNAを圧縮するとRNAポリメラーゼの結合が阻害され、遺伝子発現がダウンレギュレーションされます。^[1]遺伝子転写を促進する調節ドメインは通常、酸性活性化因子であり、酸性アミノ酸と疎水性アミノ酸で構成され、遺伝子転写を抑制する調節ドメインは通常、より多くの塩基性アミノ酸を含みます。^[1] ATFが転写に与える影響に影響を与える要因には、調節ドメインと転写部位の距離、細胞の種類、調節ドメイン内に存在する活性化配列または抑制配列の数などがあります。^[1]遺伝子転写を促進する活性化ドメイン、調節ドメインは、転写を5～40倍にアップレギュレーションする能力があることが多く、RNA調節ドメインは転写レベルを100倍に高めることが示されています。^[1]遺伝子を抑制するための別の戦略は、ATFが天然の転写因子と競合し、RNAポリメラーゼによる転写を物理的にブロックすることです。ただし、天然の転写因子よりもDNA配列に対する親和性が高いATFを作成することは依然として課題です。^[1]

リンカーは、DNA結合ドメインと調節ドメインを共有結合または非共有結合で結び付けます。^{[1 ]}ペプチドリンカーがよく使用されますが、ポリエチレングリコールや小分子リンカーも存在します。 [1]リンカーにより、DNA結合ドメインと調節ドメインを交換できるようになり、天然の転写因子成分から新しいATFを設計できます。^[1]リンカーはあまり研究されていませんが、リンカーの長さは、調節ドメインが遺伝子発現に与える影響の程度を変えるため重要です。^[1]

ほとんどのATFは、既存のDNA結合ドメインと調節ドメインを交換して、新しい標的部位と転写調節結果を持つATFを生成することによって構築されています。^[1] CRISPR-Casなどの新しい標的機能を備えた設計されたDNA結合ドメインは、より高い特異性を生み出し、潜在的な副作用を制御するために研究されています。^[2]将来的には、生理学的シグナルに反応し、特定の細胞タイプの転写レベルのみを変更し、電気穿孔を使用せずに簡単に送達できるATFが非常に注目されています。^[1]

クラスター化された規則的に間隔を置いた短い回文反復配列 - Cas（CRISPR -Cas）システムは、単一のガイドRNA（sgRNA）を使用して特定のDNA配列を標的とするために広く研究されてきました。^[5] ATFアプリケーションでは、CRISPR-Casシステムは、Cas酵素の自然な機能を不活性化し、制御ドメインをCas酵素にリンクするように変更されています。^[2] CRISPR-Casシステムは、sgRNAと標的DNA配列間の高い特異性と新しいsgRNAの設計の単純さから恩恵を受けています。しかし、CRISPR-Casシステムでは、標的DNA部位のすぐ上流にPAM配列が必要であり、Casタンパク質のサイズが大きいため細胞への送達が妨げられます。^[2]

転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、34アミノ酸の長いセグメントを繰り返したペプチド構造で、全長340～510アミノ酸のペプチドを形成します。^[2]各繰り返しセグメントは2つのアルファヘリックスに折り畳まれ、繰り返しセグメントの残基位置12と13のアミノ酸がDNA結合配列を決定します。^[2] TALEペプチドは標的DNAに対する高い特異性を持ち、二次的な副作用を防ぎますが、この高い特異性によりATFが複数の部位に結合するのが妨げられ、目的の効果ごとに異なるATFが必要になります。^[2]

ジンクフィンガーは天然に豊富に存在し、複数の調節プロセスに関与しており、一般的な真核生物の転写因子である。^[6] Cis2/His2 ジンクフィンガーは広範囲に研究されており、30 個のアミノ酸で構成され、非回文配列に結合でき、相補結合配列を指定するアルファヘリックスの 1、3、6 番目の位置に 3 ～ 4 個の重要なアミノ酸を含む。^{[4] [7] [8]}ジンクフィンガーは 30 個のアミノ酸のみであるため、送達が容易であり、複数のジンクフィンガーを連結して 1 つの ATF でより大きな DNA 配列を標的とすることができる。ただし、3 個を超えるジンクフィンガーを連結すると、各ジンクフィンガーの特異性が低下し、オフサイト標的化が増加する。^[2]

細胞分化の方向づけと細胞運命の再プログラミングは、従来、転写因子の混合によって達成されてきました。^[9] 4 つの転写因子 Oct4/Sox2/cMyc/Klf4 が、細胞を分化状態から胚性幹細胞に似た誘導多能性幹細胞状態に再プログラムすることが発見されて以来、この分野は大きな関心を集めています。 ^[10] 3 つのジンクフィンガータンパク質が結合した複数の ATF は、それぞれが遺伝子を活性化し、最終的に細胞内で Oct4 転写因子の生成につながるため、外部の Oct4 転写因子を追加することなく、細胞を誘導多能性状態に再プログラムできます。^[2]細胞状態の変化は、ATF が細胞の再プログラミングにおいて従来の転写因子を置き換えることができることを示しています。^[2]

アンジェルマン症候群は、母親のUBE3A遺伝子の不活性化によって引き起こされる神経発達障害です。^[3] ATFを使用した2つの潜在的な治療戦略は、母親のUBE3A遺伝子の発現をアップレギュレーションするか、父親のUBE3A遺伝子の抑制を引き起こす遺伝子であるUBE3A-AS遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることです。^[3]ジンクフィンガーATF TAT-S1はUBE3A-AS遺伝子に対する強力なリプレッサーとして機能し、マウスに投与すると脳内のUbe3aが増加しました。^[3]

異常な遺伝子発現は、がんや腫瘍の無秩序な増殖と関連していることが常であり、ATF はがん治療の有望な治療法となっています。^[4] ATF では 6 つのジンクフィンガーが連結されているため、ATF は ATF 内の各ジンクフィンガーに相補的な小さなサブシーケンスを含む 18 塩基対のシーケンスにのみ結合します。そのため、ATF は特定の 3 ～ 4 塩基対のシーケンスのみを標的とする 1 つのジンクフィンガーよりも特異性があります。^[4] KRAB リプレッサー調節ドメインに連結された ATF は、がん細胞の化学療法に対する薬剤耐性を低下させ、活性化ドメインに連結された ATF は Bax 遺伝子の発現をアップレギュレーションして細胞のアポトーシスを引き起こしますが、これらの治療法は、送達方法が不十分なため、まだ初期段階にあります。^[4]

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