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部位特異的変異誘発は、遺伝子などの特定のDNA配列、またはその遺伝子産物に特異的かつ意図的な変異を導入するために用いられる分子生物学的手法です。部位特異的変異誘発またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発とも呼ばれ、 DNA、RNA、タンパク質分子の構造と生物学的活性の研究、およびタンパク質工学に広く用いられています。この用語は、さまざまな異なるメカニズムで機能する多数の技術を包含しており、いずれも特定の核酸配列内に1つ以上の正確な標的ヌクレオチド変異（挿入、欠失、または置換）を導入するという同じ目標を持っています。
部位特異的変異誘発は、DNA配列に突然変異を導入することによってDNAライブラリーを作成するための最も重要な実験室的方法の1つですが、 de novoオリゴヌクレオチド合成のコストが低下するにつれて、人工遺伝子合成は既存のDNA配列に突然変異を導入するより一般的な代替手段となっています。部位特異的変異誘発を実現するための新しい技術は開発され続けています。たとえば、原核生物のウイルス防御システムに基づくCRISPR /Cas9技術の開発により、生体内でゲノムを正確に標的編集する ことが可能になり、これは部位特異的変異誘発の一種とみなされることもあります。[ 1 ]
放射線や化学変異原を用いた初期の変異誘発の試みは部位特異的ではなく、予測不可能な場所にランダムな変異を生じさせた。[ 2 ]その後、核酸アナログやその他の化学物質が局所的な点変異を生じさせるために使用された。[ 3 ]そのような化学物質の例としては、アミノプリン、[ 4 ]ニトロソグアニジン、[ 5 ]および亜硫酸水素塩[ 6 ]などがある。部位特異的変異誘発は、1974 年にチャールズ・ワイスマンの研究室で、ヌクレオチドアナログである N4-ヒドロキシシチジンを用いて初めて達成された。これはGC から AT への遷移変異を誘発する。 [ 7 ] [ 8 ]しかし、これらの変異誘発法は、達成できる変異の種類に制限があり、後の部位特異的変異誘発法よりも非特異的なオフターゲット変異が生じる可能性が高い。
1971年、クライド・ハッチソンとマーシャル・エッジルは、ファージΦX174の小さな断片と制限ヌクレアーゼを用いて変異体を作製できることを示した。[ 9 ] [ 10 ]ハッチソンは後に共同研究者のマイケル・スミスと共に、 DNAポリメラーゼを用いたプライマー伸長法でオリゴヌクレオチドを使用することにより、部位特異的変異誘発に対するより柔軟なアプローチを開発した。[ 11 ]このプロセスの開発における彼の役割により、スミスは後に、ポリメラーゼ連鎖反応を発明したキャリー・B・マリスと共に、1993年10月にノーベル化学賞を共同受賞した。
部位特異的変異導入の基本的な手順は、短いDNAオリゴヌクレオチドプライマーの合成を必要とする。この合成プライマーは、目的の変異を含み、変異部位周辺のDNA配列と相補的であるため、 DNAテンプレートとハイブリダイズすることができる。変異は、1つ以上の塩基置換（点変異）、欠失、または挿入から構成される。次に、この一本鎖プライマーを起点として、DNAポリメラーゼが相補的なテンプレートから遺伝子の残りの部分をコピーし、新しいDNA分子を合成する。こうして合成された分子は変異部位を含み、プラスミドベクターを用いて宿主細胞に導入され、クローニングされる。最後に、形質転換細胞から増殖したコロニーから精製したプラスミドDNAのDNA配列決定を行い、目的の変異が含まれていることを確認する。
単一プライマー伸長法を用いた従来の方法は、変異体の収率が低いため非効率的であった。この方法で得られた混合物には、元の非変異テンプレートと変異鎖の両方が含まれており、変異体と非変異体の混在集団が生じる。さらに、テンプレートはメチル化されているのに対し、変異鎖は非メチル化されており、メチル化されたテンプレートDNAを優先するミスマッチ修復システムが存在するため、変異体が逆選択され、結果として変異体の数が減少する可能性がある。その後、変異誘発の効率を向上させるための多くの手法が開発されてきた。
現在では部位特異的変異誘発を実現するための多くの技術が利用可能であるが、[ 12 ] 2000年代初頭以降、それらのほとんどは研究室でほとんど使用されていない。これは、より新しい技術によって、遺伝子に部位特異的変異を導入するより速く簡単な方法が可能になったためである。
1985年、トーマス・クンケルは、変異体を選択する必要性を減らす技術を導入した。[ 13 ]変異させるDNA断片は、M13mp18/19などのファージミドに挿入され、その後、 dUTPase（dut）とウラシル脱グリコシダーゼ（udg ）の2つの酵素が欠損した大腸菌株に形質転換される。これらの酵素は両方とも、 dCTPの自発的な脱アミノ化によって細菌染色体を突然変異から保護するDNA修復経路の一部である。dUTPaseの欠損はdUTPの分解を妨げ、細胞内のdUTPレベルが高くなる。ウラシル脱グリコシダーゼの欠損は、新しく合成されたDNAからウラシルを除去することを妨げる。二重変異体大腸菌がファージDNAを複製する際、その酵素機構がdTTPの代わりにdUTPを誤って取り込む可能性があり、その結果、ウラシルを含む一本鎖DNA（ssUDNA）が生成される。培地に放出されたバクテリオファージからssUDNAを抽出し、変異導入のテンプレートとして使用する。目的の変異を含むオリゴヌクレオチドをプライマー伸長に使用する。形成されるヘテロ二本鎖DNAは、dUTPを含む親非変異鎖とdTTPを含む変異鎖から構成される。次に、このDNAを野生型dut遺伝子とudg遺伝子を持つ大腸菌株に形質転換する。ここで、ウラシルを含む親DNA鎖が分解され、結果として得られるDNAのほぼすべてが変異鎖となる。
他の方法とは異なり、カセット変異導入法では、DNAポリメラーゼを用いたプライマー伸長は不要です。この方法では、DNA断片を合成し、プラスミドに挿入します。[ 14 ]この方法では、プラスミドの制限酵素部位で制限酵素による切断を行い、続いて目的遺伝子の変異を含む相補的なオリゴヌクレオチドのペアをプラスミドに連結します。通常、プラスミドとオリゴヌクレオチドを切断する制限酵素は同じであるため、プラスミドと挿入断片の粘着末端が互いに連結できます。この方法では、ほぼ100%の効率で変異体を生成できますが、変異させる部位を挟む適切な制限酵素部位の有無によって制限されます。
カセット変異導入における制限酵素部位の制限は、オリゴヌクレオチド「プライマー」を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）によって克服できる。これにより、2つの便利な制限酵素部位を含むより大きな断片が生成される。PCRにおける指数関数的増幅により、目的の変異を含む断片が十分な量で生成され、ゲル電気泳動によって元の変異していないプラスミドから分離できる。その後、標準的な組換え分子生物学技術を用いて、元のコンテキストに挿入することができる。この技術には多くのバリエーションがある。最も単純な方法は、変異部位を断片の一方の端に配置するもので、断片の生成に使用される2つのオリゴヌクレオチドのうちの1つに変異が含まれる。これはPCRの1ステップで済むが、非常に長いプライマーを使用しない限り、変異部位の近くに適切な制限酵素部位が必要であるという固有の問題が依然として存在する。したがって、他のバリエーションでは、3つまたは4つのオリゴヌクレオチドを使用し、そのうち2つは、2つの便利な制限酵素部位をカバーして、消化してプラスミドに連結できる断片を生成する非変異誘発性オリゴヌクレオチドであり、一方、変異誘発性オリゴヌクレオチドは、便利な制限酵素部位から十分に離れたその断片内の場所に相補的である。これらの方法では、連結される最終断片に目的の変異が含まれるように、複数のPCRステップが必要となる。目的の変異と関連する制限酵素部位を持つ断片を生成するための設計プロセスは煩雑になる可能性がある。SDM-Assist [ 15 ]のようなソフトウェアツールは、プロセスを簡素化できる。
プラスミド操作に関しては、他の部位特異的変異導入技術は、効率は高いが比較的単純で使いやすく、キットとして市販されている技術にほぼ取って代わられています。これらの技術の一例として、「Quikchange」法[ 16 ]があり、この方法では、相補的な変異導入プライマーのペアを使用して、Pfuポリメラーゼなどの高忠実度非鎖置換型DNAポリメラーゼを用いたサーマルサイクリング反応でプラスミド全体を増幅します。この反応により、ニックの入った環状DNA分子が生成されます。テンプレートDNAは、メチル化DNAに特異的なDpn Iなどの制限酵素による酵素消化によって除去する必要があります。ほとんどの大腸菌株の細胞で複製されるすべてのDNAはメチル化されています。したがって、大腸菌で生合成されるテンプレートプラスミドは消化されますが、 in vitroで生成されメチル化されていない変異プラスミドは消化されません。これらの二本鎖プラスミド変異導入法では、サーマルサイクリング反応が使用される場合があるが、元のプロトコルで説明されているように、2つのプライマーが変異導入部位周辺の同じ領域に左右対称に結合するように設計されている場合、DNAは指数関数的に増幅されないことに注意されたい。この場合、増幅は線形であり、連鎖反応がないため、この手順をPCRと表現するのは不正確である。しかし、プライマーがオフセットして結合するように設計され、変異導入部位が両方のプライマーの5'末端に近い場合、プライマーの3'領域も増幅産物に結合することができ、指数関数的な産物形成が観察される。「Quikchange」という名称は、部位特異的変異導入キットに関するStratagene（現在はAgilent Technologies）の登録商標「QuikChange mutagenesis」に由来する。この方法は、Stratageneで働く科学者によって開発された。[ 16 ]
Pfuポリメラーゼは、より高い伸長温度（≥70 °C）で鎖置換を起こす可能性があり 、実験の失敗につながる可能性があるため、伸長反応は推奨温度である68 °Cで行う必要があることに注意してください。一部のアプリケーションでは、この方法によりプライマーの複数コピーが挿入されることが観察されています。[ 17 ]この方法の変種であるSPRINPは、これらのアーティファクトを防ぎ、さまざまな種類の部位特異的変異誘発に使用されています。[ 17 ]
オリゴ指向性標的のスキャン変異誘発（SMOOT）などの他の技術では、プラスミド変異誘発において変異誘発性オリゴヌクレオチドを半ランダムに組み合わせることができます。[ 18 ]この技術では、単一の変異から遺伝子全体にわたる包括的なコドン変異誘発まで、幅広いプラスミド変異誘発ライブラリーを作成できます。
2013年以降、 CRISPR /Cas9ゲノム編集技術の開発により、さまざまな生物のゲノムDNAにさまざまな変異を効率的に導入することが可能になった。この方法はトランスポゾン挿入部位を必要とせず、マーカーも残さず、その効率性と簡便性からゲノム編集の好ましい方法となっている。[ 21 ] [ 22 ]
部位特異的変異誘発は、改良された特性や特殊な特性を持つ、合理的に設計されたタンパク質を生成する可能性のある変異を生成するために用いられる（すなわち、タンパク質工学）。
調査ツール– DNA の特定の変異により、DNA 配列またはタンパク質の機能と特性を合理的なアプローチで調査できます。さらに、部位特異的変異誘発によるタンパク質の単一アミノ酸の変化は、翻訳後修飾の重要性を理解するのに役立ちます。たとえば、基質タンパク質の特定のセリン (リン酸化受容体) をアラニン (リン酸化非受容体) に変更すると、リン酸基の付加がブロックされ、リン酸化を調査できます。このアプローチは、キナーゼHIPK2によるタンパク質CBPのリン酸化を明らかにするために使用されました[ 23 ]。もう 1 つの包括的なアプローチは、部位飽和変異誘発であり、1 つのコドンまたは一連のコドンを特定の位置で可能なすべてのアミノ酸に置換することができます。 [ 24 ]
商業用途– タンパク質は、特定の用途に合わせて調整された変異型を生成するように設計されることがあります。たとえば、一般的に使用されている洗濯用洗剤にはサブチリシンが含まれている場合がありますが、その野生型には漂白剤によって酸化されるメチオニンがあり、その過程でタンパク質の活性が著しく低下します。[ 25 ]このメチオニンはアラニンや他の残基に置き換えられ、酸化に対する耐性が高まり、漂白剤の存在下でもタンパク質の活性が維持されます。[ 26 ]
DNAオリゴヌクレオチド合成のコストが低下するにつれて、完全な遺伝子をde novoで人工的に合成することは、遺伝子に突然変異を導入するための実行可能な方法となった。この方法により、複数の部位にわたる広範な突然変異誘発が可能となり、特定の生物での発現を最適化するために遺伝子のコドン使用を完全に再設計することも可能となる。[ 27 ]
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