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デリット・ペルフェット（イタリア語: [ deˈlitto perˈfɛtto ] ）は、酵母における生体内部位特異的突然変異誘発のための遺伝子技術である。この名称はイタリア語で「完全なる殺人」を意味し、ゲノムに外来DNAを残さずに目的の遺伝子変化を起こせるこの技術の能力を表している。
この技術は、国立環境衛生科学研究所（NIEHS）のマイケル・A・レスニック、フランチェスカ・ストリチ（現在はジョージア工科大学）、L・ケビン・ルイス（現在はサウスウエスト・テキサス州立大学）からなるグループによって開発されました。この方法は、合成オリゴヌクレオチドと相同組換えという細胞プロセスを組み合わせて使用します。そのため、相同組換え効率の高い酵母の遺伝子操作に最適です。デリット・パーフェット法は、単一および複数の点変異、遺伝子の切断または挿入、および遺伝子全体の欠失（必須遺伝子を含む）を生成するために使用されています。
この技術の最大の利点は、突然変異誘発処理後にゲノムから外来DNAを完全に除去できることです。これにより、予期せぬ影響を引き起こす可能性のある選択マーカーや標的化に使用された外来配列がゲノム内に残存しないことが保証されます。
デリット ・ペルフェット法は、他の生体内部位特異的変異誘発法と比較しても簡便である。他の方法では、変異誘発を確認するために複数のクローニングステップと広範なDNAシーケンスが必要であり、これはしばしば複雑で非効率的なプロセスである。[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]
この手法には大きな柔軟性があり、COREカセットを挿入した後（詳細は方法の概要を参照）、目的遺伝子に複数の変異を容易かつ迅速に導入することができる。
この方法は、コケ植物のPhyscomitrella patens、ニワトリのDT40細胞、大腸菌など、相同組換えが効率的に起こる他の生物にも適用できる。さらに、酵母人工染色体（YAC）を用いることで、ヒト遺伝子を研究したり、酵母内で同様の遺伝子操作を行ったりすることも可能となる。
デリット・ペルフェット法は相同組換えに基づいているため、この技術が機能するには細胞内で相同組換えが正常に行われている必要がある。サッカロミセス・セレビシエでは、RAD52遺伝子が相同組換えに必須であり、したがってデリット・ペルフェット法にも必要となる。
この方法は、選択マーカーが不要な用途にのみ有効です。例えば、変異誘発処理を施した酵母株は、四分子分析などの遺伝子解析には使用できません。マーカーは、別の工程で適切な遺伝子座に挿入する必要があります。
Delitto Perfettoは、生体内突然変異誘発のための2段階法である。最初の段階では、相同組換えによってCOREカセットを目的の領域に挿入する。続いて、COREカセットを目的の変異を含むDNAに置き換える。
COREカセットには、CO選択マーカーとREポーター遺伝子の両方が含まれています。レポーター遺伝子は、プロセスの最初のステップでCOREカセットを受け取る酵母細胞を選択するために使用します。一方、カウンターセレクティブマーカーは、プロセスの2番目のステップで変異オリゴヌクレオチドの組み込みによってCOREカセットを失う酵母細胞を選択するために使用します。
さまざまなレポーター遺伝子、カウンターセレクティブマーカー、およびその他の機能を含む、さまざまなCOREカセットから選択できます。[ 4 ]
まず、挿入される染色体部位と相同な領域を含むプライマーを用いて、COREカセットをPCRにより増幅します。COREカセットは相同組換えによって組み込まれます。COREカセットを含む細胞はレポーター遺伝子を用いて選択することができ、さらにカウンターセレクティブマーカーを用いて確認できます。COREカセットが正しい染色体位置に組み込まれたことは、組み込み部位の上流、CORE内、および組み込みサイズの下流にアニーリングするプライマーを用いたPCRにより検証できます。これらのプライマーは500～1500 bpの断片を生成するように設計されています。[ 4 ]
COREを含む酵母細胞に、相同組換え中にCOREカセットが失われるような目的の変異を含むオリゴヌクレオチドを導入する。形質転換体は、カウンターセレクティブマーカーを用いて選択され、レポーター遺伝子を用いてさらにスクリーニングすることができる。シーケンス解析により、追加の変異がなく正しい変異が生成されたことを確認する。あるいは、変異によって制限酵素部位が生成または消失する場合は、PCR後に制限酵素消化を行うことで、目的の変異が組み込まれたことを確認できる。[ 4 ]
オリゴヌクレオチドのCOREカセットへのターゲティングを増やすには、GAL1 -I- Sce Iフィーチャーを含むCOREカセットを使用できます。このフィーチャーにより、S. cerevisiaeゲノムの他の場所にはまず存在しない非常にユニークな18ヌクレオチド配列を認識するエンドヌクレアーゼであるSceIが発現します。SceIエンドヌクレアーゼはSceI部位でDSBを生成し、 DNA修復機構をリクルートすることができます。[ 8 ]これにより、DSBが生成されない場合と比較して、標的相同組換えの頻度が4,000倍増加します。[ 6 ]
80～100 bpのオリゴヌクレオチドは、単一分子として、または完全に重複する、あるいは部分的に重複するオリゴヌクレオチドのペアとして生成できます。推奨されるオリゴヌクレオチドの種類は、変異の種類と、変異がCOREカセット挿入部位からどの程度離れているかによって異なります。
オリゴヌクレオチドが長いほど形質転換効率が高くなります。完全に相補的なオリゴヌクレオチドペアは、単一のオリゴヌクレオチドと比較して効率が 5～10 倍向上し、すべての用途に推奨されます。[ 4 ] [ 9 ]ただし、CORE カセットから 20～40 塩基の狭い範囲にしか変異導入できません。変異導入範囲を広げるには、20 bp のオーバーラップを持つオリゴヌクレオチドペアを使用できます。これにより、CORE 挿入部位の上流と下流に最大 100 bp までを標的にできます。ただし、形質転換効率は約 6 分の 1 になります。効率を上げるには、部分的にオーバーラップするオリゴヌクレオチドをin vitro で伸長できます。[ 9 ]
ノックアウトする領域の上流配列の直後に下流配列が続くオリゴヌクレオチドが設計される。遺伝子欠失の場合、完全に重複する80～100 bpのオリゴヌクレオチドのペアは、単一のオリゴヌクレオチドよりも形質転換効率が5～10倍向上する。[ 4 ]
COREカセットから20～40 bpの変異には、80～100 bpの完全に重複するオリゴヌクレオチドが推奨されます。COREカセットから40 bpを超える変異には、部分的に重複するオリゴヌクレオチドを使用する必要があります。形質転換効率を高めるために、部分的に重複するオリゴヌクレオチドはin vitroで伸長することが推奨されます。[ 4 ] [ 6 ] [ 9 ]
必須遺伝子の変異体を生成するには、CORE カセットを目的遺伝子の下流に挿入することができますが、これにより変異可能な遺伝子領域が制限されます。あるいは、二倍体細胞を使用することもできます。しかし、二倍体を使用すると、オリゴヌクレオチドが組み換えを行うのに適した染色体上の位置が 2 つ存在するため、オリゴヌクレオチドのターゲティング効率が低下します。この欠点に対処するために、DSB を介した delitto perfetto 法を使用できます。これにより、DSB が発生しない場合と比較して、標的相同組換えの頻度が 700 倍増加します。さらに、他の利用可能な方法よりも 2 ～ 5 倍効率的です。[ 6 ] [ 9 ]
二本鎖切断が発生しない場合、標的オリゴヌクレオチドがない状態でCOREカセットを失う細胞の数は、生存細胞10⁷個あたり1個未満の形質転換体であることが報告されている。対照的に、二本鎖切断が発生すると、この数は生存細胞10⁷個あたり最大100個の形質転換体に増加する。二倍体では、相同染色体との相同組換えにより背景突然変異率が上昇し、標的形質転換イベントは全形質転換体のわずか4%に減少する。[ 6 ]