DNAシーケンサー

DNAシーケンサー

DNAシーケンサー
メーカー	ロシュ、イルミナ、ライフテクノロジーズ、ベックマン・コールター、パシフィック・バイオサイエンス、MGI/BGI、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ

DNAシーケンサーは、 DNA 配列決定プロセスを自動化するために使用される科学機器です。DNA サンプルが与えられると、 DNA シーケンサーを使用して、G (グアニン)、C (シトシン)、A (アデニン)、T (チミン) の 4 つの塩基の順序が決定されます。これは、リードと呼ばれるテキスト文字列として報告されます。一部の DNA シーケンサーは、ヌクレオチドに付着した蛍光色素から発生する光信号を分析するため、光学機器と見なすこともできます。

最初の自動DNAシーケンサーはロイド・M・スミスによって発明され、1987年にアプライド・バイオシステムズ社によって導入されました。 ^[1]このシーケンサーはサンガー法を採用しており、この技術は「第一世代」のDNAシーケンサーの基礎を形成し^{[2] [3]} 、 2001年のヒトゲノムプロジェクトの完了を可能にしました。 ^[4]この第一世代のDNAシーケンサーは、基本的に、標識されたDNA断片の移動を検出する自動電気泳動システムです。したがって、これらのシーケンサーは、DNA断片の長さのみを決定する必要がある遺伝子マーカーの遺伝子型判定にも使用できます（例：マイクロサテライト、AFLP）。

ヒトゲノムプロジェクトは、ヒトゲノムの配列を決定するための次世代シーケンサー（NGS）と呼ばれる、より安価で高スループットでより正確なプラットフォームの開発を促進しました。これには、454、SOLiD、およびイルミナDNAシーケンシングプラットフォームが含まれます。次世代シーケンシングマシンは、以前のサンガー法と比較して、DNAシーケンシングの速度を大幅に向上させました。DNAサンプルはわずか90分で自動的に準備でき、^[5]ヒトゲノムは数日で15倍の範囲で配列決定できます。^[6]

PacBio SMRTやOxford Nanoporeなどの最近の第 3 世代 DNA シーケンサーは、Illumina SBS や MGI Tech の DNBSEQ などの短い読み取り技術と比較して、長い分子のシーケンスが可能になります。

DNAシーケンサー技術の限界により、これらの技術の多くはゲノムの長さに比べて読み取りが短いため、読み取りをより長いコンティグに組み立てる必要があります。^{[7]データには、DNAシーケンシング技術の限界や}PCR増幅中のエラーによって生じたエラーが含まれる場合もあります。DNAシーケンサーメーカーは、どのDNA塩基が存在するかを検出するためにさまざまな方法を使用しています。異なるシーケンシングプラットフォームに適用される特定のプロトコルは、生成される最終データに影響を与えます。したがって、異なる技術間でデータの品質とコストを比較することは困難な作業になる可能性があります。各メーカーは、シーケンシングエラーとスコアを通知する独自の方法を提供しています。ただし、異なるプラットフォーム間のエラーとスコアを常に直接比較できるとは限りません。これらのシステムは異なるDNAシーケンシングアプローチに依存しているため、最適なDNAシーケンサーと方法の選択は通常、実験の目的と利用可能な予算によって異なります。^[2]

最初のDNAシーケンシング法は、ギルバート（1973）^[8]とサンガー（1975）^[9]によって開発されました。ギルバートは、DNAの化学修飾とそれに続く特定の塩基での切断に基づくシーケンシング法を導入しましたが、サンガーの技術はジデオキシヌクレオチドの連鎖停止に基づいています。サンガー法は、効率が向上し、放射能が低いため人気を博しました。最初の自動DNAシーケンサーは、1986年にApplied Biosystemsによって導入されたAB370Aでした。AB370Aは、96サンプルを同時に、1日あたり500キロベースでシーケンシングし、最大600塩基の読み取り長に到達できました。これが「第1世代」のDNAシーケンサーの始まりであり、^{[2] [3]}サンガーシーケンシング、蛍光ジデオキシヌクレオチド、ガラス板の間に挟まれたポリアクリルアミドゲル（スラブゲル）を実装しました。次の大きな進歩は、1995年に発売されたAB310でした。これは、スラブゲルの代わりにキャピラリー内の線状ポリマーを使用して電気泳動でDNA鎖を分離するものです。これらの技術は、2001年のヒトゲノムプロジェクトの完了の基礎を形成しました。^[4]ヒトゲノムプロジェクトは、次世代シーケンサー（NGS）として知られる、より安価で高スループットで正確なプラットフォームの開発を促進しました。 2005年に454 Life Sciencesが454シーケンサーを発売し、続いて2006年にAgencourtによってSolexaゲノムアナライザーとSOLiD（サポート付きオリゴライゲーション検出）が発売されました。Applied Biosystemsは2006年にAgencourtを買収し、2007年にはRocheが454 Life Sciencesを買収し、IlluminaがSolexaを買収しました。Ion Torrentは2010年に市場に参入し、Life Technologies（現在のThermo Fisher Scientific）に買収されました。また、BGI はComplete Genomics をMGI傘下に収めた後、中国でシーケンサーの製造を開始しました。これらは、競争力のあるコスト、精度、パフォーマンスにより、現在でも最も一般的な NGS システムです。

最近では、第 3 世代の DNA シーケンサーが導入されました。これらのシーケンサーで適用されるシーケンシング方法は、DNA 増幅 (ポリメラーゼ連鎖反応 – PCR) を必要としないため、シーケンシング前のサンプル準備が高速化され、エラーが減少します。さらに、シーケンシング データは、相補鎖にヌクレオチドが追加されることによって引き起こされる反応からリアルタイムで収集されます。2 つの企業が、第 3 世代のシーケンサーで異なるアプローチを導入しました。Pacific Biosciences のシーケンサーは、シングル分子リアルタイム (SMRT) と呼ばれる方法を使用しており、蛍光色素を含む酵素によって相補鎖にヌクレオチドが追加されたときに放出される光 (カメラでキャプチャ) によってシーケンシング データが生成されます。Oxford Nanopore Technologies は、ナノポア センシング技術に基づく電子システムを使用して第 3 世代のシーケンサーを開発している別の企業です。

DNAシーケンサーは、以下の企業などによって開発・製造・販売されています。

454 DNAシーケンサーは、商業的に成功した最初の次世代シーケンサーでした。^{[10]これは}454 Life Sciencesによって開発され、2007年にロシュによって買収されました。454は、テンプレート株にヌクレオチドを追加するときにDNAポリメラーゼ反応によって放出されるピロリン酸の検出を利用しています。

ロシュ社は現在、ピロシーケンシング技術をベースにしたGS FLX+とGSジュニアシステムの2つのシステムを製造している。^[11] GS FLX+システムはおよそ1000塩基対の読み取り長を約束し、GSジュニアシステムは400塩基対の読み取りを約束している。^{[12] [13]} GS FLX+の前身である454 GS FLX Titaniumシステムは2008年にリリースされ、品質フィルター後の精度99.9%で、実行あたり0.7Gのデータ出力と最大700bpの読み取り長を達成した。2009年、ロシュ社は、最大400bpの読み取り長を持ち、ライブラリの準備とデータ処理を簡素化した454シーケンサーのベンチトップバージョンであるGSジュニアを発売した。

454システムの利点の1つは、その実行速度です。ライブラリ作成の自動化とエマルジョンPCRの半自動化により、人手を削減できます。454システムの欠点は、同じヌクレオチドの長い文字列の塩基数を推定するときにエラーが発生しやすいことです。これはホモポリマーエラーと呼ばれ、6つ以上の同じ塩基が連続している場合に発生します。^[14]もう1つの欠点は、試薬の価格が他の次世代シーケンサーと比較して比較的高価であることです。

2013年にロシュ社は454技術の開発を中止し、その技術が競争力を失った2016年に454マシンを完全に廃止すると発表した。^{[15] [16]}

ロシュ社は454シーケンスデータの解析に最適化されたソフトウェアツールを多数製造している。^[17]例えば、

• GS Run Processorは、シーケンス実行によって生成された生の画像を強度値に変換します。^[18]このプロセスは、画像処理と信号処理という2つの主要なステップで構成されています。ソフトウェアはまた、個々の読み取りに対して正規化、信号補正、ベースコーリング、品質スコアを適用します。ソフトウェアは、データ分析アプリケーション（GS De Novo Assembler、GS Reference Mapper、またはGS Amplicon Variant Analyzer）で使用するために、標準フローグラム形式（またはSFF）ファイルでデータを出力します。
• GS De Novo Assemblerは、ショットガンリードのみ、または454シーケンサーによって生成されたペアエンドデータと組み合わせて、最大3GBの全ゲノムをde novoアセンブリするためのツールです。また、転写産物のde novoアセンブリ（分析を含む）とアイソフォーム変異の検出もサポートしています。^[17]
• GS Reference Mapperは短い読み取りを参照ゲノムにマッピングし、コンセンサス配列を生成します。このソフトウェアは挿入、削除、SNPを示す評価用の出力ファイルを生成できます。あらゆるサイズの大規模で複雑なゲノムを処理できます。^[17]
• 最後に、GSアンプリコンバリアントアナライザーは、アンプリコンサンプルからの読み取りを参照に対してアラインメントし、バリアント（リンクされているかどうか）とその頻度を識別します。また、未知のバリアントや低頻度のバリアントを検出するためにも使用できます。アラインメントを分析するためのグラフィカルツールが含まれています。^[17]

イルミナは、マンテイア・プレディクティブ・メディシンから買収し、ソレクサが開発した技術を使用して、数多くの次世代シーケンシングマシンを製造しています。^{[19]イルミナは、この技術を使用して、HiSeq、Genome Analyzer IIx、MiSeq、HiScanSQなど、}マイクロアレイも処理できる数多くの次世代シーケンシングマシンを製造しています。^[20]

これらのDNAシーケンサーにつながる技術は、2006年にSolexa社がGenome Analyzerとして初めてリリースしました。^[10] Illumina社は2007年にSolexa社を買収しました。Genome Analyzerは合成によるシーケンシング方式を採用しています。最初のモデルは1回の実行で1Gの遺伝子を生成しました。2009年中に、出力は8月の実行で20Gから12月の実行で50Gに増加しました。2010年にIllumina社は、実行で200G、その後8日間で600Gの出力を持つHiSeq 2000をリリースしました。発売当時、HiSeq 2000は、北京ゲノム​​研究所の試算によると、100万塩基あたり0.02ドルという最も安価なシーケンシングプラットフォームの1つを提供しました。

2011年にイルミナはMiSeqと呼ばれるベンチトップシーケンサーをリリースしました。リリース当時、MiSeqはペアエンド150bpの読み取りで1回の実行あたり1.5Gを生成できました。自動化されたDNAサンプル調製を使用すると、シーケンシングの実行は10時間で実行できます。^[10]

Illumina HiSeqは、DNAクラスターの数と位置を計算してシーケンス品質を評価するために、HiSeq制御システムとリアルタイムアナライザーという2つのソフトウェアツールを使用しています。これらの方法は、近くのクラスターが互いに干渉しているかどうかを評価するのに役立ちます。^[10]

ライフテクノロジーズ（現サーモフィッシャーサイエンティフィック）は、アプライドバイオシステムズとイオントレントのブランドでDNAシーケンサーを製造しています。アプライドバイオシステムズは、SOLiD次世代シーケンシングプラットフォーム^[21]や、3500ジェネティックアナライザーなどのサンガーベースのDNAシーケンサーを製造しています。^[22]アプライドバイオシステムズは、イオントレントブランドで、イオンPGMシステム、イオンプロトンシステム、イオンS5、イオンS5xlシステムの4つの次世代シーケンサーを製造しています。^[23]同社はまた、2018年初頭にリリースされる予定のSeqStudioと呼ばれる新しいキャピラリーDNAシーケンサーを開発中であると考えられています。 ^[24]

SOLiDシステムは2006年にApplied Biosystemsに買収されました。SOLiDはライゲーションとデュアルベースエンコーディングによるシーケンシングを適用します。最初のSOLiDシステムは2007年に発売され、1回のランで35bpの読み取り長と3Gのデータを生成しました。5回のアップグレードの後、5500xlシーケンシングシステムが2010年にリリースされ、読み取り長が85bpに大幅に増加し、精度が最大99.99%向上し、7日間のランで30Gを生成しました。^[10]

SOLiDの読み取り長の制限は依然として大きな欠点であり^[25]、再配列解析やトランスクリプトーム解析、最近ではChIP-Seqやメチル化実験など、読み取り長がそれほど重要でない実験にその使用がある程度制限されています。^[10] SOLiDシステムのDNAサンプル調製時間は、Tecanシステムなどのシーケンシングライブラリ調製の自動化により大幅に短縮されました。^[10]

SOLiDプラットフォームによって生成された色空間データは、さらなる分析のためにDNAベースにデコードすることができますが、元の色空間情報を考慮するソフトウェアを使用すると、より正確な結果が得られます。ライフテクノロジーズは、再配列、ChiP-Seq、トランスクリプトーム分析用のデータ分析パッケージであるBioScope ^[26]をリリースしました。これは、MaxMapperアルゴリズムを使用して色空間の読み取りをマッピングします。

ベックマン・コールター（現ダナハー）は、CEQ 8000を含む、CEQというモデル名でチェーンターミネーションとキャピラリー電気泳動ベースのDNAシーケンサーを製造していた。 ^[27]同社は現在、ダイターミネーターシーケンシングを使用するGeXP遺伝子解析システムを製造している。^[28]この方法では、PCRとほぼ同じようにサーモサイクラーを使用してDNA断片を変性、アニール、伸長させ、配列決定された断片を増幅する。^{[29] [30]}

パシフィックバイオサイエンスは、単一分子リアルタイムシーケンシング（SMRT）法を使用して、PacBio RSおよびSequelシーケンシングシステムを製造しています。 ^[31]このシステムは、数千塩基対の読み取り長を生成できます。生の読み取りエラーが大きい場合は、同じ鎖を何度も読み取る循環コンセンサスまたは最適化されたアセンブリ戦略を使用して修正します。^[32]科学者は、これらの戦略で99.9999％の精度を報告しています。^[33] Sequelシステムは、容量の増加と価格の引き下げにより2015年に発売されました。^{[34] [35]}

オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズのMinIONシーケンサーは、進化するナノポアシーケンシング技術を核酸分析に応用したものである。 ^[37]このデバイスは長さが4インチで、USBポートから電源を得る。MinIONは、分子が膜に吊り下げられたナノポアを毎秒450塩基の速度で通過するときに、DNAを直接デコードする。 ^[38]電流の変化によって、存在する塩基が示される。当初、このデバイスの精度は60～85％であったが、従来の機械では99.9％であった。^[39]不正確な結果であっても、長い読み取り長を生成するため有用であることが判明する可能性がある。^[40] 2021年初頭、ブリティッシュコロンビア大学の研究者らは特殊な分子タグを使用し、一度に多くの長いDNAをシーケンシングする場合でも、デバイスの5～15％のエラー率を0.005％未満に低減することに成功した。^[41] MinIONをベースにした製品イテレーションがさらに2つある。 1つ目はGridIONで、これは少し大きめのシーケンサーで、一度に最大5つのMinIONフローセルを処理できます。2つ目はPromethIONで、これは10万ものポアを並列に使用し、大容量のシーケンシングに適しています。^[42]

MGIは、独自のDNBSEQテクノロジーに基づき、DNBSEQ-G50、DNBSEQ-G400、DNBSEQ-T7などの科学研究および臨床応用のためのハイスループットシーケンサーを製造しています。^[43]これは、DNAナノボールシーケンシングとコンビナトリアルプローブアンカー合成技術に基づいており、DNAナノボール（DNB）が流体システムを介してパターン化されたアレイチップにロードされ、その後、シーケンシングプライマーがDNBのアダプター領域に追加されてハイブリダイゼーションされます。DNBSEQ-T7は、1日あたり最大60のヒトゲノムという非常に大規模なショートリードを生成できます。^[44] DNBSEQ-T7は、30Xシーケンシングで150 bpのペアエンドリードを生成し、SARS-CoV-2またはCOVID-19のゲノムをシーケンシングして、重度のCOVID-19疾患における遺伝子変異の素因を特定するために使用されました。^[45]中国国立遺伝子銀行の研究者らは、新しい技術を用いて、 MGIのPCRフリーDNBSEQアレイ上でPCRフリーライブラリを配列決定し、初めて真のPCRフリー全ゲノム配列決定を達成した。^{[46] MGISEQ-2000は、} Nature Medicineに掲載されているように、COVID-19患者の根本的な病因と回復を研究するために単一細胞RNA配列決定に使用された。^[47]

DNAシーケンシング技術の現在の提供内容は、イルミナ（2019年12月）が主要プレーヤーであり、続いてPacBio、MGI、Oxford Nanoporeとなっています。