核酸構造決定

RNAやDNAなどの核酸の構造を決定する実験的アプローチは、生物物理学的方法と生化学的方法に大別できます。生物物理学的方法は、 X線結晶構造解析、NMR、クライオ電子顕微鏡など、分子の基本的な物理的特性を利用して構造を決定します。生化学的方法は、特定の試薬と条件を使用して核酸の構造を分析し、核酸の化学的特性を利用します。 ^{[1]このような方法は、特定の試薬を使用した化学的プローブを伴う場合もあれば、ネイティブまたは}アナログ化学に依存する場合もあります。異なる実験アプローチには独自の利点があり、異なる実験目的に適しています。

DNA も RNA も容易に結晶を形成しないため、核酸単体ではX 線結晶構造解析は一般的ではありません。これは、核酸構造の本質的な無秩序性とダイナミズムの程度が大きく、負に帯電した (デオキシ) リボースリン酸骨格が近接すると互いに反発するためです。したがって、結晶化した核酸は、構造秩序を提供し、負電荷を中和するために、対象のタンパク質と複合化される傾向があります。^{[引用が必要]}

核酸NMRは、NMR分光法を用いてDNAやRNAなどの核酸分子の構造と動態に関する情報を得る方法です。2003年時点で、既知のRNA構造のほぼ半分がNMR分光法によって決定されています。^[2]

核酸 NMR はタンパク質 NMR と同様の技術を使用するが、いくつかの違いがある。核酸には、NMR で通常観察される原子である水素原子の割合が少なく、核酸の二重らせんは硬くほぼ直線状であるため、それ自体に折り返されて「長距離」相関関係を与えることはない。^[3] 核酸で通常行われる NMR の種類は、 ¹ H またはプロトン NMR、¹³ C NMR、¹⁵ N NMR、および³¹ P NMRである。2 次元 NMR法は、ほとんどの場合、結合を介した核結合を検出する相関分光法 (COSY) および全コヒーレンス移動分光法 (TOCSY)、および空間的に互いに近接する核間の結合を検出する核オーバーハウザー効果分光法 (NOESY) などで使用される。 ^[4]

スペクトルから得られるパラメータ、主にNOESYクロスピークと結合定数は、グリコシド結合角、二面角（Karplus方程式を使用）、糖パッカー立体配座などの局所的な構造的特徴を決定するために使用できる。大規模構造の場合、これらの局所パラメータを他の構造仮定またはモデルで補完する必要がある。これは、二重らせんを横切るにつれて誤差が加算され、タンパク質とは異なり、二重らせんはコンパクトな内部を持たず、それ自体に折り返されないためである。NMRは、曲がったらせん、非ワトソン-クリック型塩基対形成、同軸スタッキングなどの非標準的な形状の調査にも有用である。NMRは、ステムループや擬似結び目などの複雑な立体配座をとる傾向がある天然RNAオリゴヌクレオチドの構造を調べるのに特に有用である。NMRは、他の分子（タンパク質や薬物など）への核酸分子の結合を調べるのにも有用であり、他の分子が結合するとどの共鳴がシフトするかを見ることによって調べる。^[4]

極低温電子顕微鏡法（クライオ電子顕微鏡法）は、水溶液中で極低温に保存されたサンプルを電子ビームで画像化する技術である。液体サンプルを小さな金属グリッド上にピペットで移し、液体窒素槽で極低温に保たれたエタン/プロパンの液体溶液に浸す。この凍結プロセスでは、サンプル内の水分子は氷に見られるような六方格子を形成する時間がないため、サンプルはガラス状の水のような状態（ガラス化氷とも呼ばれる）で保存され、電子ビームを使用してこれらのサンプルをより簡単に画像化できる。X線結晶構造解析と比較したクライオ電子顕微鏡法の利点は、サンプルが水溶液の状態で保存され、サンプルの結晶形成によって乱されないことである。1つの欠点は、約75キロダルトン未満の核酸またはタンパク質構造を解像することが難しいことである。これは、このガラス化水溶液中の粒子を見つけるのに十分なコントラストを得るのが難しいことが一因である。もう 1 つの欠点は、サンプルに関する原子レベルの構造情報を取得するには、多数の画像 (電子顕微鏡写真と呼ばれることが多い) を撮影し、それらの画像を平均化する必要があることです。このプロセスは、単一粒子再構成と呼ばれます。これは、計算集約型のプロセスです。

クライオ電子顕微鏡は、透過型電子顕微鏡(TEM) のより新しい、より摂動の少ないバージョンです。サンプルを表面に乾燥させないため摂動が少なく、この乾燥プロセスはネガティブ染色 TEMでよく行われ、クライオ電子顕微鏡では、生体分子の構造に影響を及ぼす可能性のある重金属塩 (酢酸ウラニルやリンタングステン酸など) などの造影剤を必要としないため摂動が少なくなります。透過型電子顕微鏡は、サンプルが電子ビームと相互作用し、サンプルのうち電子ビームと相互作用しない部分だけが電子検出システムに「透過」することを技術として利用します。一般に、TEM は 1960 年代から核酸構造を決定するための有用な技術となっています。^{[5] [6]}二本鎖DNA（dsDNA）の構造は、一本鎖領域と二本鎖領域が交互に並んだ典型的な意味では、伝統的に構造とは見なされないかもしれないが、実際には、dsDNAは、DNAの熱変動や、γ四重鎖のように形成される可能性のある代替構造のために、その長さのどの位置でも単純に完全に整列した二重らせんではない。核酸のクライオ電子顕微鏡法は、リボソーム、^[7]ウイルスRNA、^[8]およびウイルス内の一本鎖RNA構造に対して行われてきた。^{[9] [10]}これらの研究では、核酸塩基レベル（2〜3オングストローム）から三次構造モチーフ（ナノメートル以上）までのさまざまな解像度で構造的特徴を解明した。

RNA化学プローブ法では、RNAと反応する化学物質を使用します。重要なのは、その反応性がRNAの局所構造、例えば塩基対合やアクセシビリティに依存することです。したがって、反応性の違いは、配列に沿った構造の足跡として機能します。異なる試薬はRNA構造上の異なる位置で反応し、異なる反応スペクトルを持ちます。^[1]最近の進歩により、多数のRNAの構造を同時に研究すること（トランスクリプトーム全体のプローブ法）^[11]と、細胞環境におけるRNA分子の直接分析（細胞内プローブ法）が可能になりました。^[12]

構造化 RNA は、まず、所定のインキュベーション時間、プローブ試薬と反応します。これらの試薬は、反応部位で RNA 上に共有結合付加物を形成します。逆転写酵素を使用して RNA が DNA コピーに逆転写されると、付加物によって酵素がブロックされるため、生成された DNA は反応位置で切断されます。したがって、切断されたさまざまな長さの DNA 分子のコレクションから、すべての塩基位置での反応頻度がわかり、RNA に沿った構造プロファイルが反映されます。これは、従来、DNA をゲル上で流すことによってアッセイされ、バンドの強度から、各位置での切断の観察頻度がわかります。最近のアプローチでは、ハイスループット シーケンシングを使用して、より高いスループットと感度で同じ目的を達成しています。

反応性プロファイルは、特定の仮説に基づいて特定の位置での構造の程度を調べるために使用したり、計算アルゴリズムと組み合わせて使用​​して、実験的に裏付けられた完全な構造モデルを作成したりすることができます。^[13]

使用される化学試薬によっては、ヒドロキシルラジカルなどの試薬はRNA分子を切断する。切断されたDNAの結果は同じである。DMSなどの試薬は逆転写酵素を阻害せず、代わりにDNAコピーの部位でミスを引き起こすことがある。これらはハイスループットシーケンシング法を使用すると検出でき、突然変異プロファイリング（MaP）などのプローブ結果を改善するために使用されることがある。^{[14] [15]}

RNA上の位置は、局所的な構造だけでなく、その位置に結合するタンパク質によっても試薬から保護される可能性がある。このため、化学プローブを使用してタンパク質結合をアッセイする研究も行われている。^[16]

ヒドロキシルラジカルは溶液中で短命であるため、実験時に生成する必要がある。これは、H ₂ O _{2 、アスコルビン酸、およびFe(II)-EDTA複合体を使用して行うことができる。これらの試薬は、}フェントン化学によってヒドロキシルラジカルを生成するシステムを形成する。その後、ヒドロキシルラジカルは核酸分子と反応することができる。^[17]ヒドロキシルラジカルはリボース/デオキシリボース環を攻撃し、糖リン酸骨格を切断する。結合タンパク質またはRNA三次構造から保護されている部位は、ヒドロキシルラジカルによる切断速度が低い。^[17]したがって、これらの位置はゲル上にバンドが存在しない、またはシーケンシングによるシグナルが低いこととして現れる。^{[17] [18]}

ジメチル硫酸（DMS）は、核酸の二次構造を決定するために使用できる化学物質です。DMSとの反応により、その部位にメチル付加物が付加され、メチル化と呼ばれます。特に、DMSは、塩基対形成時に自然な水素結合が形成される部位に位置するアデニン（A）のN1とシトシン（C）のN3をメチル化します[ 19 ] 。^{したがって}、修飾は、一本鎖のAおよびC核酸塩基、らせん末端で塩基対を形成する塩基、またはGUウォブルペアまたはその隣の塩基対でのみ起こり、後者の2つは、塩基対形成が時折開く位置です。さらに、修飾部位は塩基対形成できないため、修飾部位はRT-PCRによって検出できます。RT-PCRでは、メチル化された塩基で逆転写酵素が切断され、異なる切断されたcDNAが生成されます。これらの切断されたcDNAは、ゲル電気泳動またはハイスループットシーケンシングによって特定できます。

切断ベースの方法を改良した DMS 変異プロファイリングとシーケンシング (DMS-MaPseq) では、単一の RNA 分子で複数の DMS 修飾を検出できるため、読み取りごとにより多くの情報を取得でき (150 nt の読み取りの場合、通常は 0 ～ 1 つの切断部位ではなく 2 ～ 3 つの変異部位)、低存在量の RNA の構造を決定し、代替の二次構造を持つ RNA のサブポピュレーションを識別できます。^[20] DMS-MaPseq は、熱安定性グループ II イントロン逆転写酵素(TGIRT) を使用します。この酵素は、DMS によってメチル化された塩基に遭遇するとcDNAに変異 (切断ではなく) を作成しますが、それ以外の場合は高い忠実度で逆転写します。結果として得られる cDNA をシーケンシングすると、逆転写中に変異した塩基が特定されます。これらの塩基は、元の RNA では塩基対になっていなかった可能性があります。

DMS修飾はDNAにも使用することができ、例えばDNA-タンパク質相互作用のフットプリント測定に用いられる。^[21]

プライマー伸長法（SHAPE ）によって分析される選択的2'-ヒドロキシル化は、構造的に柔軟な領域でRNAのバックボーンを優先的に修飾する試薬を利用します。

N-メチルイサト酸無水物（NMIA）や1-メチル-7-ニトロイサト酸無水物（1M7）^[22]などの試薬は、2'-ヒドロキシル基と反応して、RNAバックボーンの2'-ヒドロキシルに付加物を形成します。他のRNAプローブ技術で使用される化学物質と比較して、これらの試薬は、塩基の同一性にほとんど左右されない一方で、コンフォメーションダイナミクスには非常に敏感であるという利点があります。制約されたヌクレオチド（通常は塩基対形成によって）は、対になっていないヌクレオチドよりも付加物の形成が少なくなります。付加物の形成は、特定のRNA内の各ヌクレオチドについて、逆転写酵素による相補的DNAプライマーの伸長と、得られたフラグメントを未改変コントロールのフラグメントと比較することによって定量化されます。^[23] したがって、SHAPEは個々のヌクレオチドレベルでRNA構造を報告します。このデータは、高精度の二次構造モデルを生成するための入力として使用できます。^[24] SHAPEは、HIV-1ゲノム全体を含む多様なRNA構造の解析に使用されています。^[25] 最良のアプローチは、化学プローブ試薬と実験データの組み合わせを使用することです。^{[26] SHAPE-Seqでは、SHAPEは}RNA-Seqと組み合わせたバーコードベースのマルチプレックス化によって拡張され、ハイスループットで実行できます。^[27]

カルボジイミド部分は、脱プロトン化されたNによる求核攻撃を受けて、露出した核酸塩基（ウラシル、および程度は低いがグアニン）と共有結合付加物を形成することもできる。これらは主にウラシルのN3とグアニンのN1と反応し、塩基上の水素結合を担う2つの部位を修飾する。^[19]

1-シクロヘキシル-(2-モルホリノエチル)カルボジイミドメト-p-トルエンスルホン酸は、CMCTまたはCMCとしても知られ、RNA構造のプローブに最も一般的に使用されるカルボジイミドです。^{[29] [30]} DMSと同様に、逆転写とそれに続くゲル電気泳動またはハイスループットシーケンシングによって検出できます。GとUに反応するため、AとCに情報を提供するDMSプローブ実験のデータを補完するために使用できます。^[31]

1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドはEDCとしても知られ、CMCと同様の反応性を示す水溶性カルボジイミドであり、RNA構造の化学的プローブとしても使用されます。EDCは細胞内に浸透することができるため、RNAの本来の環境で直接細胞内プローブとして使用されます。^{[32] [28]}

いくつかの 1,2-ジカルボニル化合物は、N1 および N2 で一本鎖グアニン (G) と反応し、ワトソン-クリック面で 5 員環付加物を形成します。

1,1-ジヒドロキシ-3-エトキシ-2-ブタノンはケトキサールとしても知られ、1,2-ジカルボニルに関連する構造を持ち、このカテゴリーではRNAの化学的プローブに広く使用された最初の化合物です。ケトキサールはグアニンの修飾を引き起こし、具体的には共有結合によってN1と環外アミノ基（N2）を同時に変化させます。^[35]

グリオキサール、メチルグリオキサール、フェニルグリオキサールはいずれも重要な1,2-ジカルボニル基を持ち、ケトキサールと同様に遊離グアニンと反応し、構造化RNA中の不対グアニン塩基のプローブとして使用できます。これらの試薬は化学的性質上、細胞内に容易に浸透するため、RNAを本来の細胞環境で分析するために使用できます。^[34]

光活性化RNA構造検査（LASER）プロービングは、UV光を利用してニコチノイルアジド（NAz）を活性化し、水中で反応性の高いニトレニウムカチオンを生成します。これは、バリアレスフリーデルクラフツ反応により、RNAのC-8位の溶媒アクセス可能なグアノシンおよびアデノシンと反応します。LASERプロービングは、溶媒アクセス可能である限り、一本鎖および二本鎖残基の両方をターゲットにします。ヒドロキシルラジカルプロービングでは、RNAの溶媒アクセス性をin vivoで測定するためにシンクロトロン放射が必要であるため、多くの研究室では細胞内のRNAのフットプリントにヒドロキシルラジカルプロービングを適用することは困難です。対照的に、LASERプロービングは励起に手持ち式UVランプ（20 W）を使用するため、 RNAの溶媒アクセス性をin vivoで研究するためにLASERプロービングを適用する方がはるかに簡単です。この化学プローブ法は光制御可能であり、細胞内のRNA結合タンパク質の足跡を残すことが示されている核酸塩基の溶媒アクセス性を調べます。^[36]

インラインプロービングでは、RNA構造を変更するためにいかなる種類の化学物質や試薬による処理も行われません。このタイプのプロービングアッセイでは、RNAの構造依存的な切断を使用します。一本鎖領域はより柔軟で不安定であり、時間の経過とともに劣化します。^[38]インラインプロービングのプロセスは、リガンドの結合による構造の変化を決定するためによく使用されます。リガンドの結合により、さまざまな切断パターンが発生する可能性があります。インラインプロービングのプロセスでは、構造RNAまたは機能RNAを長期間インキュベートします。この期間は数日間かかる場合がありますが、実験ごとに異なります。次に、インキュベートされた生成物をゲル上で流してバンドを視覚化します。この実験は、多くの場合、1)リガンドあり、2)リガンドなしの2つの異なる条件を使用して行われます。^[37] 切断によりバンドの長さが短くなり、塩基対形成されていない領域を示します。塩基対形成領域は自発的な切断に対して敏感ではない傾向があるためです。^[38] インラインプロービングは、リガンド結合に対するRNAの構造変化を決定するために使用できる機能アッセイです。リガンドに対するRNA領域の柔軟性と結合の変化を直接示すことができ、その反応を類似のリガンドと比較することもできます。このアッセイは、特にリボスイッチを調べる際に動的研究でよく使用されます。^[38]

ヌクレオチド類似体干渉マッピング（NAIM）は、ヌクレオチド類似体（いくつかの点でヌクレオチドに似ているが機能がない分子）を使用して、RNA分子の各位置にある官能基の重要性を決定するプロセスです。^{[39] [40]} NAIMのプロセスは、単一のヌクレオチド類似体を固有のサイトに挿入することです。これは、T7 RNAポリメラーゼを使用して短いRNAを転写し、特定の位置に類似体を含む短いオリゴヌクレオチドを合成し、リガーゼを使用してDNAテンプレート上でそれらを連結することによって行うことができます。^[39] ヌクレオチド類似体はホスホロチオエートでタグ付けされ、RNA集団の活性メンバーが不活性メンバーと区別され、不活性メンバーはホスホロチオエートタグが除去され、ゲル電気泳動とオートラジオグラフィーを使用して類似体サイトが識別されます。^[39] これは機能的に重要なヌクレオチドを示しています。ヨウ素によるホスホロチオエートの切断により、ヌクレオチド類似体挿入部位で切断されたRNAが生成されます。これらの切断されたRNA分子をゲル上で実行することにより、目的のヌクレオチドをシーケンシング実験に対して特定できます。^[40] 部位特異的組み込みの結果は重要な位置を示しており、ゲル上で実行した場合、その位置に類似体が組み込まれた機能的RNAにはバンドが表示されますが、類似体が機能しない場合は、機能的RNA分子をゲル上で実行しても、ゲル上のその位置に対応するバンドは表示されません。^[41] このプロセスは、領域全体を評価するために使用することができ、アナログは特定の場所に単一のヌクレオチドによって異なり、次に機能的なRNAを分離してゲル上で実行すると、バンドが生成されたすべての領域は非必須ヌクレオチドを示しますが、機能的なRNAからバンドが存在しない領域は、その位置にヌクレオチドアナログを挿入することでRNA分子が非機能的になったことを示します^[39]