単一粒子分析

単粒子分析は、透過型電子顕微鏡（TEM）の画像を分析するために使用される、関連するコンピュータ画像処理技術のグループです。 ^{[1]これらの方法は、粒子サンプル、通常は}タンパク質またはウイルスなどの他の大きな生物学的実体 のTEM画像から取得できる情報を改善および拡張するために開発されました。染色された粒子または染色されていない粒子の個々の画像はノイズが多く、解釈が困難です。類似の粒子のデジタル化された画像をいくつか組み合わせると、より明確で解釈しやすい特徴を持つ画像が得られます。この技術の拡張では、単粒子法を使用して粒子の3次元再構成を構築します。クライオ電子顕微鏡を使用することで、サブナノメートル 解像度とほぼ原子解像度の再構成を生成できるようになりました^{[2] [3]}最初は高度に対称的なウイルスの場合でしたが、現在ではより小さく非対称なタンパク質でも可能になっています。^{[4]単粒子分析は}、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS） によっても実行できます。

単一粒子分析は、ネガティブ染色されたサンプルとガラス質氷包埋透過型電子顕微鏡（CryoTEM）サンプルの両方で行うことができます。単一粒子分析法は、一般的にサンプルが均質であることを前提としていますが、構造の不均一性に対処する技術^[5]が開発されています。

画像（顕微鏡写真）は、リン光層に結合された電荷結合素子（CCD）検出器を使用して電子顕微鏡で撮影されます（以前は、フィルムに収集され、高品質のスキャナーを使用してデジタル化されていました）。画像処理は、多くの場合、マルチプロセッサコンピュータ クラスターで実行される専用のソフトウェアプログラムを使用して実行されます。サンプルまたは必要な結果に応じて、2 次元または 3 次元の処理のさまざまな手順を実行できます。

さらに、ICP-MS ユニットを使用した個別粒子モードでの単一粒子分析も実行できます。

生物学的サンプル、特に薄いガラス質の氷に埋め込まれたサンプルは放射線に非常に敏感であるため、サンプルを画像化するために使用できる電子線量は低くなります。この低線量と、使用される金属染色（使用されている場合）の変動^[6]は、観察されている粒子によって提供される信号に比べて画像のノイズが多いことを意味します。いくつかの類似した画像を互いに位置合わせして平均化することで、より高い信号対雑音比の画像を得ることができます。ノイズはほとんどランダムに分布しており、基礎となる画像の特徴は一定であるため、複数の画像にわたって各ピクセルの強度を平均化することで、一定の特徴のみが強化されます。通常、1つの画像を別の画像にマッピングするための最適な位置合わせ（平行移動と面内回転）は、相互相関によって計算されます。

しかし、顕微鏡写真には、複数の異なる方向や構造の粒子が含まれていることが多く、より代表的な画像平均を得るには、類似した粒子画像を複数のセットにグループ化する方法が必要です。これは通常、多変量統計分析や階層的優位分類、またはk平均クラスタリングなどのいくつかのデータ分析および画像分類アルゴリズムのいずれかを使用して実行されます。^{[引用が必要]}

多くの場合、数万の粒子画像のデータセットが使用され、最適なソリューションに到達するために、位置合わせと分類の反復的な手順が使用されます。これにより、分類によって生成された強力な画像平均が、データセット全体の後続の位置合わせの参照画像として使用されます。

画像フィルタリング (バンドパスフィルタリング) は、画像内の高空間周波数情報や低空間周波数情報の影響を減らすためによく使用されます。これらの情報は、位置合わせや分類の手順の結果に影響を及ぼす可能性があります。これは、ネガティブ染色画像で特に役立ちます。アルゴリズムは高速フーリエ変換 ( FFT ) を使用し、多くの場合、逆格子空間でガウス形状のソフトエッジマスクを使用して特定の周波数範囲を抑制します。ハイパスフィルタは、低空間周波数 (ランプ効果や勾配効果など) を除去し、高周波数はそのまま残します。ローパスフィルタは、高空間周波数の特徴を除去し、細部をぼかす効果があります。

電子顕微鏡における画像形成の性質上、明視野TEM画像は大幅なアンダーフォーカスで得られる。これと顕微鏡のレンズ系に固有の特徴により、収集された画像は点像分布関数として見えるぼやけた状態になる。画像化条件の複合効果はコントラスト伝達関数（CTF）として知られ、逆格子空間の関数として数学的に近似することができる。位相反転や振幅補正/ウィーナーフィルタリングなどの特殊な画像処理技術は（少なくとも部分的に）^[7] CTFを補正し、高解像度の再構成を可能にする。

透過型電子顕微鏡画像は、医療用X線と同様に、物体の密度分布を示す投影画像です。投影スライス定理を利用すると、さまざまな視野角から撮影された物体の画像（2D投影）を多数組み合わせることで、物体の3次元再構成を生成できます。ガラス質氷中のタンパク質は、理想的にはランダムな方向（または視野角）の分布を採用するため、多数の粒子画像を使用すると、かなり等方的な再構成が可能になります。これは、サンプル/イメージングセットアップの形状により視野角が制限され、異方性の再構成となる電子トモグラフィーとは対照的です。フィルターバックプロジェクションは、単一粒子分析で3D再構成を生成するために一般的に使用される方法ですが、多くの代替アルゴリズムが存在します。^[3]

再構成を行う前に、各画像内のオブジェクトの方向を推定する必要があります。各画像の相対的なオイラー角を計算するために、いくつかの方法が開発されています。共通線 (共通の 1D 投影とサイノグラム)に基づくものもあれば、反復投影マッチング アルゴリズムを使用するものもあります。後者は、単純な低解像度の 3D 開始モデルから始めて、実験画像をモデルの投影と比較し、ソリューションに向けてブートストラップするための新しい 3D を作成します。

らせん状のサンプル（タバコモザイクウイルスなど）の 3D 再構成を行う方法も利用可能で、固有のらせん対称性を活用します。これらのサンプルには、実空間法（らせんのセクションを単一の粒子として扱う）と逆空間法（回折パターンを使用する）の両方を使用できます。

顕微鏡の試料ステージは傾斜させることができるため（通常は単一軸に沿って）、ランダム円錐傾斜と呼ばれる単一粒子技術が可能になります。^[8]試料の領域は、ゼロ傾斜と高角度（約60〜70度）傾斜の両方で、または関連する直交傾斜再構成法の場合は、^[9] +45度と-45度で画像化されます。2つの異なる傾斜（傾斜ペア）で同じオブジェクトに対応する粒子のペアが選択され、後続のアライメントおよび分類ステップで使用されるパラメータに従うことで、3次元再構成を比較的簡単に生成できます。これは、各粒子の視野角（3つのオイラー角として定義）が傾斜ジオメトリからわかっているためです。

ランダム円錐傾斜からの 3D 再構成では、方向の範囲が限られているために情報が欠落する問題があります。これは、逆格子空間の形状に由来する「欠損円錐」^[10]として知られ、3D マップに歪みが生じます。ただし、欠損円錐の問題は、複数の傾斜再構成を組み合わせることで解決できる場合が多くあります。傾斜法は、ネガティブ染色されたサンプルに最適で、優先方向でカーボン サポート フィルムに吸着する粒子に使用できます。帯電またはビーム誘起運動^[11]として知られる現象により、ガラス質氷内のサンプルの高傾斜画像の収集が困難になります。

3Dマップを表示できるさまざまなソフトウェアプログラムが利用可能であり、多くの場合、ユーザーはサブユニットのタンパク質座標（X線結晶構造解析またはNMRからの構造）を電子密度に手動でドッキングすることができます。いくつかのプログラムでは、サブユニットを計算的にフィットさせることもできます。^{[12] [13]}

より高解像度の構造を得るには、他の方法による事前の構造知識がなくても、高分子を直接構築することが可能である。このタスクのためにコンピュータアルゴリズムも開発されている。^[14]

高解像度のクライオ電子顕微鏡モデルは比較的新しいため、品質管理ツールはX線モデルほど豊富ではありません。しかし、差分密度マップのクライオ電子顕微鏡（「実空間」）バージョン、^[15]、「フリー」マップを使用したクロス検証（フリーR係数の使用に相当）、^{[16] [17]}、およびさまざまな構造検証ツールが登場し始めています。

単一粒子誘起結合プラズマ質量分析法（SP-ICP-MS）は、環境流体のサンプル中の浮遊粒子を検出および定量化し、それらの移動を評価し、粒子のサイズと分布を評価し、特定の環境でのそれらの安定性を決定する可能性があるいくつかの分野で使用されています。 SP-ICP-MSは、2000年にクロード・ドゥゲルドルによって粒子懸濁液用に設計されました。彼は最初にこの新しい方法論をジュネーブ大学のフォレル研究所でテストし、2002年春のEMRS会議中の「コロイド2oo2」シンポジウムと2003年の議事録でこの新しい分析アプローチを発表しました。^[18]この研究では、SP ICP-MSの理論と、粘土粒子（モンモリロナイト）と他のコロイド懸濁液で実行されたテストの結果を紹介します。この方法はその後、Degueldre & Favarger (2004) による二酸化トリウムナノ粒子、^[19] Degueldre ら (2004) による二酸化ジルコニウム^[20]、およびナノファーマシーの基質として使用される Degueldre ら (2006) による金ナノ粒子でテストされました。^[21]その後、二酸化ウランのナノ粒子とマイクロ粒子の研究から、Degueldre ら (2006) による詳細な出版物が生まれました。^[22] 2010 年以降、SP ICP-MS への関心が爆発的に高まっています。

• この新しい技術を使用すると、7.5～25Åの中解像度でタンパク質合成、リガンド結合、RNA相互作用に関する重要な情報が得られます。^[23]
• メタノコッカス・マリパルディスのシャペロニン^[24]を0.43ナノメートルの解像度で再構成した。 ^[25]この細菌タンパク質複合体は、殻の中に閉じ込められる他のタンパク質を折りたたむ機械である。
• 酵母由来の脂肪酸合成酵素^[26]を0.59ナノメートルの解像度で撮影。^[27]この巨大な酵素複合体は、細胞の生命に不可欠な長鎖脂肪酸の構築を担っています。
• アクアレオウイルスの0.33ナノメートル再構成図。^{[28] [29]}これらのウイルスは魚類や​​その他の水生動物に感染します。再構成図は、アミノ酸側鎖の密度が容易に確認できるほどの高解像度を備えています。

• EM データバンク 2019-02-05 にWayback Machineにアーカイブされました( EM データバンク)